הדפסת הזרקת דיו וניתוח הנעה של משי מבוסס עצמית הנעה מיקרו-שטירים

זהירות: נא להתייעץ עם גליונות נתונים רלוונטיים בטיחות חומרים לפני שימוש בחמצן מימן, נתרן קרבונט, אתנול, סידן כלוריד, ו מתנול. הקפידו ללבוש את כל ציוד ההגנה האישי המתאים, כולל בקרת ההנדסה בעת טיפול בכימיקלים המשמשים בפרוטוקול זה. 1. הפקת פיברומין חותכים 5 גרם של כדור משי מנוקה לתוך ~ 1 ס מ2 חתיכות קטנות באמצעות מספריים. מרתיחים 2 ליטר של מים (DI) בגביע 2 L על צלחת חמה מגנטית תחת כיסוי החילוץ. הוסף 4.24 g של נתרן קרבונט בהדרגה לאט לתוך המים רותחים כדי להימנע רותחים מעל ולתת לו להתמוסס בעזרת בר מגנטי מעורר. המתן עד שהפתרון מתחיל לרתוח שוב ולהוסיף את חתיכות החיתוך של הגלמים לתוך הפתרון. ודא כי כל המשי הוא שקוע בפתרון ולשמור את הפתרון רותח תחת ערבוב קבוע עבור 90 דקות. לכסות את הגביע בקלילות עם רדיד אלומיניום ומעלה עם מים DI מחומם באופן קבוע כדי לחדש את אובדן המים עקב אידוי. 2. ייבוש בפיברומין הסירו את הסיבים המחולצים מתמיסת הנתרן קרבונט עם מוט זכוכית או מרית ושטוף 3x עם 1 L של מים מחומם מראש עבור כל כביסה, בהדרגה להקטין את הטמפרטורה עבור כל צעד כביסה (כ 60 ° c, 40 ° c, וטמפרטורת החדר, 25 ° C). מורחים את הפיברובסיבים על 750 mL בורוסיליקט זכוכית התגבש צלחת ומניחים אותו לתוך תנור ייבוש ב 60 ° c תחת לחץ אטמוספרי ולצאת יבש בן לילה. לאחר ייבוש, לאחסן את הפיברוזה במיכל סגור בטמפרטורת החדר. 3. פירוק פיברומין להכין פתרון טרנארי (הכימית של ליסאווה) המכיל 4.8 g של מים DI, 3.7 g של אתנול, ו 3.1 g של סידן כלוריד17. מניחים בקבוקון שני הצוואר התחתון (100 mL) לתוך אמבט מים, שנעשו על ידי מילוי 750 mL בורוסיליקט זכוכית התגבש צלחת עם 600 mL של מים DI, על גבי צלחת חם מגנטי. מקם את הפתרון הטרנארי בתוך הבקבוקון. מניחים מדחום באחד הצוואר כדי לפקח על טמפרטורת הפתרון במדויק. לכסות את הצוואר השני עם רדיד אלומיניום כדי למנוע ייבוש מתוך הפתרון בשל אידוי (או להשתמש המנוע מקורר מים). מחממים את התמיסה ל80 ° c.הערה: ודא כי הנורה של מד החום נמצא בתוך הפתרון. כאשר טמפרטורת הפתרון יציבה ב-80 ° c, מסירים את רדיד האלומיניום ומוסיפים 1 גרם לתמיסה מיובשת. הוסף בר קטן מגנטי לערבב כדי להבטיח כי הפתרון מעורב היטב לאורך תהליך הפירוק. לכסות את הצוואר השני שוב עם רדיד אלומיניום כדי למזער אידוי אבל לשמור על המערכת פתוח. השאר להתמוסס עבור 90 דקות. 4. מענה דיאליזה לתמיסה לאחר 90 דקות של פירוק, להשאיר את הפתרון הפיברוב 10 דקות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. קח 1 15 ס מ שפופרת דיאליזה ארוכה (משקל מולקולרי לגזור-off 12000 ל14000 kDa) ולקשור קשר באחד משני הקצוות. רוחצים אותו לכמה דקות עם הפעלת מיים די מהברז. פתחו את הקצה השני ושופכים את התמיסה הפיברובית פנימה. בעזרת מהדק מתכת, סגרו את הקצה השני של צינור הדיאליזה ומבטיחים שהצינור סגור בחוזקה האפשרית. הצמד את אחד מקצות צינור הדיאליזה דרך כובע בורג לתוך מבחנה ריקה של 30 מ ל כדי לאפשר את שפופרת הדיאליזה לצוף במים. מלאו כימית 2 l עם 2 ליטר של מים ומניחים את צינור הדיאליזה בתוכו. מחליפים את המים במרווחי זמן קבועים. בדוק את המוליכות של המים בכל פעם שהוא משתנה כדי לעקוב אחר תהליך הדיאליזה. שלב הדיאליזה מסיים לאחר מוליכות המים הוא מתחת 10 μS/cm.הערה: תהליך זה מתבצע בדרך כלל 24 עד 36 שינויים עם 5 שינויי מים. לאחר דיאליזה הושלמה, לחתוך קצה אחד של צינור הדיאליזה עם מספריים ויוצקים את הפתרון לסדרה של 1.5 mL צינורות. אז, צנטריפוגה עבור 5 דקות ב 16,000 x g כדי להסיר את כל החלקיקים בתוך התמיסה הפיברובגית. לאסוף את supernatant בבקבוקון 30 מ ל פלסטיק ולאחסן אותו ב 4 ° c. 5. קביעת ריכוז פתרון RSF שוקלים שקופית זכוכית נקייה (W1). הוסף 200 μL של פתרון משי (V1). השאירו את הזכוכית מחליקה בתנור בגובה 60 ° c. שוקלים שוב את שקופית הזכוכית (W2). חישוב הריכוז של פתרון המשי (w/v) באמצעות הנוסחה הבאה: 6. הכנת צבעי דיו להדפסה הכן דיו (כרך הסופי 1.5 mL) על ידי ערבוב של פתרון פיברוב (40 mg/mL), פוליאתילן גליקול 400 (יתד400; 14 מ”ג/ml) ומים מיומים להדפסת הגוף העיקרי של SPMSs. להדפסת המנוע הקטליטי של SPMSs, לערבב פיברומין (40 mg/mL), יתד400 (12 מ”ג/ml), קטלאז (6 מ”ג/ml עם פעילות קטליטי של > 20000 יחידות/mg) ו מים מיולים לעשות 1.5 mL של דיו B. הכינו 1.5 mL של דיו C על ידי המסת Coomassie כחול מבריק (0.05 mg/mL) ב מתנול.הערה: מתנול משמש להמרת סלילים אקראיים יריעות ביתא קשיח על ידי הדפסת דיו C על גבי דיו A או דיו B. Coomassie כחול מבריק משמש כדי לספק צבע מנוגד של SPMSs כדי לסייע מעקב אוטומטי של SPMSs במהלך ההנעה. 7. הדפסת תלת-ממד של הזרקת דיו הערה: מדפסת הזרקת הדיו המשמשת בניסויים אלה מבוססת על התקנים מבוססי מאוד של piezo עם חרירי זכוכית. קיימות מספר מדפסות הזרקת דיו זמינות מסחרית עבור מחקר שיכולות לשכפל פונקציות אלה. השתמש בהתקני הדפסה עם קוטר החרירים 80 יקרומטר להדפסת צבעי הדפוס על מצע סיליקון הממוקם על הבמה במרחק עבודה בין הזרבובית והמצע ה-Si-וופל של כ-5 מ”מ. הצורות הגיאומטריות של SPMSs מוגדרות דיגיטלית כסדרה של נקודות קואורדינטות X-Y בקובץ גיליון אלקטרוני.הערה: המדפסת קוראת את הקואורדינטות באופן סדרתי ומפעילה את המדפסת בהתאם. כל נקודת מתאם הופכת את מטוס המדפסת פעם אחת באמצעות התקן ההדפסה. קבצי גיליון אלקטרוני נפרדים נוצרים עבור סוגי דיו A ו-B (ראה קבצים משלימים [הגוף הראשי של spms. xlsx ומנוע spms. xlsx]). טען את שלושת סוגי הדיו (A, B ו-C) לתוך שלושה מאגרים (1.5 mL כל אחד) ולאחר מכן להתאים את הלחץ על הרקע באמצעות שסתום הלחץ הרקע עבור כל ערוץ בודד כדי להבטיח את הדיו אינו נוטף התקנים מסוימים.הערה: יש צורך בשלושה התקנים מסוימים בערוצים עצמאיים. להתאים את הפרמטרים לסדר (זמן לקום 1, לשכון זמן, זמן הסתיו, זמן הסביבה, לעלות זמן 2, מתח סרק, לשכון מתח, הד מתח) עבור כל ערוץ כדי להבטיח כי כל דיו נותן היווצרות הטוב של droplet יציב (איור 2).הערה: פרמטרים אלה הם בעלי התקן מוכן לתלויות בדיו ויהיה צורך להתאימו בהתאם. הדפס את מגוון המשי בשכבת הדיו המתנול על מצעים מלוטשים מלוטש מסוג סי-וופל: שלב 1, הדפסת דיו A (גוף ראשי); שלב 2: הדפסת דיו C (ריפוי דיו); שלב 3: הדפסת דיו B (דיו קטליטי עבור אתרי מנועים); שלב 4: הדפסת דיו C (ריפוי דיו); שלב 5: חזור על שלבים 1-4 עבור השכבות הרצויות הנדרשות (לדוגמה, 100).הערה: שני עיצובים לדוגמה עבור 4 השלבים נכללים קבצים משלימים; הגוף הראשי SPMS. xlsx משמש לשלב 1 ולשלב 2 ומנוע SPMS. xlsx משמש לשלב 3 ולשלב 4. הדפס שתי אצוות של פיברוב SPMSs עם 200 שכבות ו 100 עובי שכבות, בהתאמה.הערה: מנוע הקטלאז ממוקם בצד של קצה אחד של כל מערבב. לפיכך, לניצנים יש מנוע קטליטי אחד (ראה איור 1 אזור אדום). כדי להסיר את הדגימות מהקונדיטוריה, לטבול דגימות במים DI ומתפרעים בעדינות עד התנתקות מתרחשת. 8. הקניית נתונים/מעקב וניתוח מסלול של שרירים עצמיים מתהלכים לנקות צלחת פטרי (9 ס מ קוטר) עם מים די להבטיח כי פני השטח הוא אבק חופשי. לאחר ניקוי יבש, להוסיף 10 מ ל מסונן מראש (0.45 μm) 5% w/v H2O2 לתוך צלחת פטרי ולעזוב להתיישב. הדליקו את החלק התחתון של צלחת הפטרי עם מקור אור מגניב דיודות פולטות אור (LED) ולהשתמש במצלמה במהירות גבוהה עם עדשת זום מאקרו כדי ללכוד את התנועה מלמעלה. שמור סרטי וידאו כקבצי avi.הערה: ראו טבלת חומרים לקבלת פרטים על הציוד שבשימוש. לשטוף את שרירים משי מודפס עבור 10 דקות על ידי שוקע יזוג אותם במים DI כדי להסיר כל מאוגד פג400. לקחת בזהירות מערבב שטוף אחד עם קצה של מחט מזרק סטרילי ולמקם אותו במרכז צלחת פטרי. כאשר שטף שוטפים נוגע H2O2 דלק, בועות להתחיל להרכיב סביב המנוע תנועה מעגלית של שטירר הוא נצפתה. כאשר המערכת מופיעה במצב יציב (בדרך כלל 10- 30 מאוחר יותר), הקש על הרשומה בתוכנת ההקלטה כדי להתחיל בלכידת הווידאו. בצע מעקב אחר המיקרו-מיקרו-מסגרות על מסגרת על בסיס מסגרת, מעקב אחר כל קצה של שרימרים כפי שצוין על ידי נקודות A ו-B באיור 3.הערה: ניתן לעשות זאת באופן ידני או בעזרת תוכנת מעקב. מתוך נתוני מעקב שהתקבלו, לחשב את המהירות הנקודתית בין שתי מסגרות רצופות (למשל, 1 ו-2) באמצעות המשוואה להלן ובממוצע המהירויות כתוצאה מן הרצף כולו כדי לקבל את מהירות מיידית משמעות. בנוסף לכך, לחשב את זווית האוריינטציה φ. לאחר מכן השתמש בקצב השינוי של φ כדי לקבוע את מהירות הסיבוב (איור 3).הערה: בעת חישוב מהירויות מיידי מנתוני תמונה מסומנים, חשוב שהתמונה הראשונית של אובייקט עם ממדים ידועים תהיה מסוגלת לחשב פיקסלים נכונים לערכי מיקרומטר. ערכים אלה יהיו תלויים במצלמה, במטרה ובמרחק שבשימוש. בהתאם לסוג החלקיק המודפס, בחר נקודות מעקב שונות לחישוב המהירות. לדוגמה, כאן מעקב אחר נקודות A, B ו-C (מרכז המסה) משמשות לקביעת מהירויות מיידי (איור 3). 9. אפיון של הספמ ע י SEM הסרת SPMSs בשימוש ובשימוש מתוך מענה Si-וופל או בצובר ולהעביר אותם אל 10 מילימטר רחב פחמן דביק רפידות מותקן על אלומיניום לסרוק מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) קצרמר. מייבשים את הדגימות בתנור ייבוש במשך 10 דקות ב 60 ° c. לטעון את הספחים לדוגמה לשלב הקואטר. מעיל sputter (פלזמה ארגון בשעה 0.05 Torr) 50 – 100 ננומטר של זהב על הדגימות, להבטיח כיסוי משטח הומוגנית זהב של המדגם. להסיר את הנתונים לדוגמה מן coater אטר והתמונה ב-SEM תחת ואקום ב 5.0 kV.הערה: מתח האצה גבוה מאוד יכול לצרוב את המשי ולתת תכונות שווא.