Utilizzando In Vitro e nelle celle di forma per indagare la piccola molecola ha indotto cambiamenti strutturali Pre-mRNA

Acilazione di selettivo 2′-idrossile analizzati di estensione dell’iniettore (forma) è un metodo di misurazione la cinetica di ogni nucleotide in una sequenza di RNA di interesse e la struttura secondaria a singolo nucleotide risoluzione¹. Metodologie di forma, sia in condizioni in vitro^2,3,4 (RNA purificato in un sistema tampone definito) e in vivo le cellule di mammiferi^5,6, sono stati sviluppati per indagare il secondario struttura delle sequenze di RNA di media lunghezza (in genere < 1.000 nucleotidi per forma nelle celle e < 200 nucleotidi per la forma in vitro). È particolarmente utile per valutare i cambiamenti strutturali nel recettore RNA legandosi al RNA-interacting piccola molecola metaboliti^2,4,7,8 e a studiare azioni meccanicistiche di molecole di RNA-targeting durante droga sviluppo^9,10.

RNA-targeting scoperta della droga ha recentemente attirato l’attenzione in laboratori accademici e l’industria farmaceutica^11,12 tramite diversi approcci e strategie^{13,14,15 ,16}. Esempi recenti di RNA-targeting di piccole molecole per uso clinico due farmaci sperimentali strutturalmente distinti, LMI-070¹⁷ e^18,RG-7916¹⁹, per atrofia muscolare spinale (SMA), che ha mostrato promettente Risultati in fase di test clinici II²⁰. Entrambe le molecole sono state dimostrate per la sopravvivenza di destinazione del neurone di motore (SMN) 2 pre-mRNA e regolano il processo di splicing del SMN2 gene^6,17,21. Precedentemente abbiamo dimostrato l’applicazione di in vitro e nelle celle forma un esame dei cambiamenti strutturali in presenza di un analogo di RG-7916 conosciuto come SMN-C2⁶destinazione RNA.

In linea di principio, forma misura il tasso di acilazione di 2′-OH di ogni nucleotide di una sequenza di RNA in presenza di una quantità eccessiva di un reagente di acilazione auto-estinguente in modo imparziale. Il reagente di acilazione non è stabile in acqua, con una breve emivita di (ad esempio, T_1/2 = 17 s per anidride acetica 1-metil-7-nitroisatoic; o 1 M 7, ~ 20 min per imidazolide acido 2-methylnicotinic, o NAI)²² e insensibilità all’identità del le basi²³. In questo modo un più favorevole acilazione dei gruppi 2′-OH di basi flessibile, che possono essere trasformati in un’accurata valutazione delle dinamiche di ogni nucleotide. In particolare, un nucleotide in un base-accoppiamenti è solitamente meno reattivo rispetto ad uno spaiato di un reagente modificazione di 2′-OH, come NAI e 1 M 7.

Guardando l’origine del modello RNA e dove si svolge la 2′-OH acilazione, forma possa essere classificato generalmente in forma in vitro e nelle celle. In vitro forma utilizza purificata T7 trascritti di RNA e manca un contesto cellulare in disegni sperimentali. A forma di nelle celle, 2′-OH acilazione sia la trascrizione del RNA modello si verificano nelle cellule viventi; di conseguenza, i risultati possono ricapitolare il modello strutturale di RNA in un contesto cellulare. FORMA nella cella è stato indicato come in vivo forma per la forma riportata in cellule viventi nella letteratura²⁴. Dal momento che questo esperimento non viene eseguito in un animale, abbiamo chiamato questo esperimento come forma nella cella per precisione.

Le strategie per la fase di estensione del primer di forma in vitro e nelle celle sono anche differenti. A forma di in vitro, trascrizione d’inversione si ferma nella posizione di acilazione di 2′-OH in presenza di Mg^{2 +}. Un’estensione dell’iniettore ³²P-labled appare quindi come una band in elettroforesi su gel di poliacrilamide (pagina) e l’intensità della banda è proporzionale al tasso acilazione¹. A forma di nelle celle, trascrizione inversa genera mutazioni casuali presso la 2′-OH del complesso posizione in presenza di Mn^{2 +}. Il tasso mutazionale di ogni nucleotide può essere catturato nel sequenziamento di nuova generazione di profondità, e la reattività di forma a singolo nucleotide risoluzione può quindi essere calcolata.

Un potenziale problema per la forma nella cella è il rapporto segnale-rumore basso (cioè, una maggioranza dei gruppi 2′-OH è invariata, mentre le sequenze non modificate occupano la maggior parte delle leggi nel sequenziamento di nuova generazione). Recentemente, un metodo per arricchire la 2′-OH per volta RNA, indicato come in vivo, fare clic su forma (icSHAPE), è stato sviluppato dai Chang laboratorio²⁵. Questo metodo di arricchimento può essere vantaggioso nello studio debole piccole molecole quali interazioni RNA, soprattutto in un interrogatorio del trascrittoma-wide.