Met behulp van In Vitro en In cel vorm te onderzoeken klein molecuul veroorzaakte structurele veranderingen van de Pre-mRNA

Selectieve 2′-hydroxyl acylering geanalyseerd door primer extensie (SHAPE) is een methode voor het meten van de kinetiek van elk nucleotide in een opeenvolging van RNA van belang en het ophelderen van de secundaire structuur op single-nucleotide oplossing¹. SHAPE methodologieën, zowel in in vitro voorwaarden^2,3,4 (gezuiverde RNA in een gedefinieerde buffersysteem) en in levende cellen van zoogdieren^5,6, hebben ontwikkeld om te onderzoeken van de secundaire structuur van halflang RNA-sequenties (meestal < 1000 nucleotiden in cel vorm en < 200 nucleotiden voor in vitro vorm). Het is met name handig om structurele veranderingen in de receptor RNA bij binding met RNA-interactie klein molecuul metabolieten^2,4,7,8 en te bestuderen of mechanistische acties van RNA-targeting moleculen tijdens^9,10van de ontwikkeling van de drug.

RNA-targeting drugontdekking heeft onlangs aandacht in academische laboratoria en de farmaceutische industrie^11,12 getrokken via verschillende benaderingen en strategieën^{13,14,15 ,16}. Recente voorbeelden van kleine moleculen RNA-targeting voor klinisch gebruik twee structureel verschillende experimentele drugs, LMI-070¹⁷ en RG-7916^18,19, voor spinale musculaire atrofie (SMA), waaruit veelbelovend blijkt resultaten in fase II klinische proeven²⁰. Beide moleculen werden aangetoond voor doel voortbestaan van motor neuron (SMN) 2 pre-mRNA en reguleren de splicing proces van de SMN2 gen^6,17,21. Wij eerder blijk gegeven van de toepassing van in vitro en in cel vorm in een onderzoek naar de structurele veranderingen van de target RNA in het bijzijn van een analoge van RG-7916 SMN-C2⁶genoemd.

In principe meet vorm de 2′-OH acylering snelheid van elk nucleotide van een opeenvolging van RNA in aanwezigheid van overtollige hoeveelheden een zelf blussen acylering reagens op onpartijdige wijze. Het reagens acylering is niet stabiel in water, met een korte halfwaardetijd van (bv T_1/2 = 17 s voor 1-methyl-7-nitroisatoic zwavelzuuranhydride; of 1 M 7, ~ 20 min. voor het 2-methylnicotinic zuur imidazolide, of INR)²² en ongevoeligheid voor de identiteit van de honken kwamen²³. Dit resulteert in een gunstiger acylering van de 2′-OH-groepen van flexibele grondslagen, die kunnen worden omgezet in een nauwkeurige beoordeling van de dynamiek van elk nucleotide. Specifiek, is een nucleotide in een base-paar meestal minder reactief dan een ongepaard die een 2′-OH wijzigen reagens, zoals NAI en 1 M 7.

Als we kijken naar de bron van de RNA-sjabloon en waar 2′-OH acylering plaatsvindt, kan vorm over het algemeen worden onderverdeeld in in vitro en in cel vorm. In vitro vorm gebruik gezuiverde T7 Getranscribeerd RNA en mist een cellulaire context in experimentele designs. In cel vorm plaatsvinden zowel het RNA sjabloon transcriptie en 2′-OH acylering in levende cellen; de resultaten kunnen daarom het structurele model van RNA in een cellulaire context recapituleren. In cel vorm heeft voorgelegd aan zoals in vivo vorm voor de vorm in levende cellen in de literatuur²⁴vervoerd. Aangezien dit experiment wordt niet uitgevoerd in een dier, wij dit experiment genoemd als in cel vorm voor nauwkeurigheid.

De strategieën voor de fase van de uitbreiding primer van in vitro en in cel vorm zijn ook verschillend. In de vorm van het in vitro stopt omgekeerde transcriptie op de 2′-OH acylering positie in aanwezigheid van Mg^{2 +}. Extensie primer ³²P-labelled daarom verschijnt als een band in polyacrylamide gelelektroforese (pagina), en de intensiteit van de band is evenredig aan de acylering tarief¹. In cel vorm, omgekeerde transcriptie genereert willekeurige mutaties op de 2′-OH adduct positie in aanwezigheid van Mn^{2 +}. Het vogelgriepvirus tarief van elk nucleotide kan worden onderschept door in het rangschikken van de volgende generatie van diepte en de reactiviteit van de SHAPE op single-nucleotide resolutie kan vervolgens worden berekend.

Een potentieel probleem voor in cel vorm is de lage signal-to-noise verhouding (dat wil zeggen, een meerderheid van de fracties 2′-OH is ongewijzigd, terwijl de ongewijzigde sequenties allermeest naar de lezen in de volgende-generatie sequencing bezetten). Onlangs, een methode om te verrijken de 2′-OH gemodificeerde RNA, bedoelde zoals in vivo klikt u op SHAPE (icSHAPE), werd ontwikkeld door de Chang laboratorium²⁵. Deze verrijking methode kan nuttig zijn bij het bestuderen van zwakke kleine molecules zoals RNA interacties, vooral in een transcriptome bestrijkende ondervraging.