Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

DNA wordt vaak genoemd de blauwdruk van een levende cel omdat alle structuren van de cel zijn gecodeerd in de opeenvolging van haar DNA. Nauwkeurige replicatie en DNA herstelmechanismes voorkomen dat slechts zeer lage tarieven van mutaties, die is van essentieel belang voor de instandhouding van de juiste functies van gecodeerde genen. Wijzigingen van de opeenvolging van DNA kunnen opeenvolgende functies op verschillende niveaus, beginnend met DNA (erkenning door de transcriptiefactoren en restrictie-enzymen), vervolgens RNA (base-paar complementariteit en secundaire structuur verbouwingen) en/of eiwit (amino zure vervangingen, weglatingen, toevoegingen of frame-verschuivingen). Terwijl vele mutaties genfunctie niet aanzienlijk beïnvloeden, kunnen sommige mutaties in het DNA grote gevolgen hebben. Plaats-geleide mutagenese is dus een waardevol instrument voor het bestuderen van het belang van specifieke DNA sites op alle niveaus.

Dit protocol beschrijft een gerichte mutagenese aanpak gebruikt om specifieke mutaties. Het protocol is gebaseerd op twee verschillende strategieën van de PCR: een 2-step of een 3-stap-PCR. De 2-staps-PCR is van toepassing als de gewenste mutatie dicht bij de 5′ eindigt of het einde 3′ van het DNA van belang ligt (< 200 basenparen (bp) vanaf het einde) en de 3-staps PCR geldt in alle gevallen.

In de benadering van de PCR 2-step 3 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 3, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een enkele primer is ontworpen om op te nemen van de mutatie. De invoering van de primer (primer 2) mutatie moet een omgekeerde oriëntatie als de mutatie dicht bij het 5′-eind en een voorwaartse richting ligt als de mutatie dicht bij de 3′-eind ligt. In de eerste stap van de PCR versterkt primer 1 + 2 of 2 + 3 een klein fragment dicht bij de 5′ end of 3′ end, respectievelijk. Het resulterende PCR product wordt dan gebruikt als een primer in stap twee met primer 1 of 3, dus wat resulteert in een PCR-product met een mutatie in het DNA van belang (figuur 1A).

In de 3-staps PCR, 4 primers zijn ontworpen, waarin een reeks inleidingen is ontworpen om de DNA van belang (inleidingen 1 en 4, vooruit en achteruit, respectievelijk) te vergroten en een reeks inleidingen is ontworpen voor het opnemen van specifieke mutaties met overlappende complementariteit (inleidingen 2 en 3, reverse en doorstuurt, respectievelijk). In stap één en twee, inleidingen 1 + 2- en 3 + 4 versterken het einde 5′ en 3′. In stap drie, de resulterende PCR producten uit stap 1 en 2 worden gebruikt als sjablonen en versterkt met inleidingen 1 + 4. Het resulterende PCR product is dus het DNA van belang met de gewenste Mutatie (figuur 1B).

Terwijl de gemuteerde DNA kan worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing, wordt dit protocol beschreven hoe opnieuw het combineren van het DNA in een klonen vector. Het gebruik van klonen van vectoren heeft verschillende voordelen zoals gebruiksgemak klonen en specifieke experimentele toepassingen afhankelijk van de eigenschappen van de vector. Deze functie wordt vaak gebruikt voor RNA interactie studies. Een andere techniek voor RNA interactie studies is structurele sonderen van het RNA in complex met een andere RNA^1,2 of eiwit^3,4. Echter, structurele indringende wordt alleen uitgevoerd in vitro overwegende dat plaats-geleide mutagenese en latere klonen toestaan voor interactie studies in vivo.

Plaats-geleide mutagenese is uitgebreid gebruikt voor RNA interactie studies zoals hier gepresenteerd. Echter de belangrijkste met betrekking tot 2 – of 3-staps PCR-methode is van toepassing op elk stuk van DNA, en dus niet alleen beperkt tot RNA-interactie studies.

Om te illustreren de techniek en het mogelijke gebruik ervan, wordt karakterisering van regio’s belangrijk voor verordening van de post-transcriptional van het mRNA, csgD, van Escherichia coli (E. coli) gebruikt. In E. coli, csgD wordt gericht door de kleine niet-coderende RNA, McaS, in samenwerking met een eiwit, Hfq, te onderdrukken van eiwit-expressie van CsgD^2,4,5. De techniek wordt gebruikt voor het invoeren van mutaties voor de regio van base-paring tussen csgD en McaS, en op de site van de bindende Hfq van csgD. Het verkregen DNA wordt vervolgens gekloond in een vector geschikt voor latere experimenten. Downstream toepassingen van de techniek omvatten zowel in vivo en in vitro experimenten. Ter illustratie, voorbeeld 1 is gekenmerkt in vivo met behulp van een westelijke vlek assay en voorbeeld 2 in vitro met behulp van een kwantitatieve analyse van elektroforetische mobiliteit, shift (EMSA) wordt gekenmerkt. In beide gevallen is geïllustreerd hoe plaats-geleide mutagenese kan worden gebruikt in combinatie met andere technieken voor het maken van biologische conclusies over een gen van belang.