Количественные экспертизы по чувствительности к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae агрегатов с помощью АТФ использования коммерческих анализов и Live/мертвые пятнать
Summary
Простой АТФ измерительные пробирного и/мертвые окрашивания метода были использованы для количественной оценки и визуализировать Neisseria gonorrhoeae выживание после лечения с Цефтриаксон. Этот протокол может быть расширен для изучения антимикробного воздействия любой антибиотик и может использоваться для определения минимальной ингибирующее концентрацию антибиотиков в бактериальные биопленки.
Abstract
Появление устойчивых к антибиотикам Neisseria gonorrhoeae (GC) представляет собой угрозу для здоровья во всем мире и подчеркивается необходимость выявления лиц, которые не лечение. Это грамотрицательные бактерии вызывает гонорею исключительно в организме человека. Во время инфекции она способна формы агрегатов и/или биопленки. Минимальная концентрация тормозной (MIC) тест используется для определения чувствительности к антибиотикам и определить соответствующее лечение. Однако механизм ликвидации в естественных условиях и его связь с лабораторных результатов не известны. Был разработан метод, который проверяет как GC агрегации влияет на чувствительности к антибиотикам и показывает связь между совокупный размер и чувствительности к антибиотикам. Когда GC агрегат, они более устойчивы к антибиотикам убийства, с бактериями в центре выжившие Цефтриаксон лечения лучше, чем те, на периферии. Эти данные указывают, что N. gonorrhoeae агрегирование может уменьшить свою подверженность цефтриаксон, который не отражается Стандартный агар пластины-методов на основе MIC. Метод, используемый в данном исследовании позволит исследователям для тестирования бактериальных Восприимчивость клинически соответствующих условиях.
Introduction
Гонорея является общим половым путем инфекции (STI)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), грамотрицательные бактерии diplococcal, является возбудителем этого заболевания. Симптомы инфекции половых органов может привести к боли во время мочеиспускания, обобщенные половых боль и мочеиспускательного канала разряда. Инфекция часто бессимптомной2,3,,45, и это позволяет для расширенной колонизации. Эти необработанные инфекций являются основных проблем системы здравоохранения, поскольку они имеют потенциал для облегчения передачи организма, и это может привести к осложнениям, например, воспалительные заболевания тазовых органов (PID) и распространены гонококковая инфекция (DGI)6. Устойчивых к антибиотикам гонорея — кризис общественного здравоохранения и растущее социально-экономическое бремя7. Уменьшенной восприимчивости к цефалоспорины привело к изменению режима лечения от одного антибиотика для двойной терапии, которая сочетает в себе доксициклина или азитромицина с Цефтриаксон8. Увеличение неудача Цефтриаксон и азитромицин9,10, в сочетании с бессимптомной инфекции, подчеркивает необходимость понимания неудач лечения гонореи.
Минимальная концентрация тормозной (MIC) теста, включая агар разрежения и диск диффузии испытаний, был использован как стандартный медицинский тест для определения устойчивости к антибиотикам. Тем не менее неясно, если тест MIC отражает бактерий к антибиотикам в естественных условиях. Формирование бактериальные биопленки способствует выживания бактерий в присутствии бактерицидные концентрации антибиотика: MIC тестирования не удается обнаружить этот эффект11. Потому что GC может формировать биоплёнки слизистой поверхности12, мы предполагаем, что антибиотика чувствительности в пределах агрегатов будет отличаться от что видел в отдельных GC. Кроме того исследования показали, что трехфазные переменной поверхности молекул, пили, непрозрачность связанные белком (Opa), и lipooligosaccharides (Лос), которые регулируют взаимодействие между бактерия, привести к различным размером агрегатов13, 14 , 15. вклад этих компонентов к антибиотикам не были рассмотрены из-за отсутствия надлежащих методов.
В настоящее время существует несколько методов для измерения искоренение биопленки. Наиболее широко используемый количественных методом является измерение изменений в биомассе, используя фиолетовый кристалл, окрашивание16. Однако этот метод требует значительных экспериментальных манипуляций, который потенциально может генерировать ошибки в эксперимент повторяется17. Метод окрашивания жить/мертвые, используемый здесь позволяет визуализации живых и мертвых бактерий и их распределения в рамках биопленки. Однако структура биопленки может представлять как физический барьер, который уменьшает проникновение красителя. Таким образом для количественной оценки жить/Мертвые бактерии внутри группы, окрашивание ограничивается малых биоплёнки или его предшественником microcolonies или агрегатов. Другие методы, включая тесты диффузии агар разрежения и диск, не способны измерить воздействие агрегации. Для изучения GC восприимчивость внутри агрегата после антибиотикотерапии экспозиции, идеальный метод будет необходимо иметь оба количественных assay который может измерить живут бактерии и визуализировать их распределения.
Процедуру, описанную здесь сочетает АТФ использование измерения и жить/мертвые пятнать количественно assay для и визуально изучить вызовы GC восприимчивость в агрегаты присутствии антибиотики.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бактерии могут образовывать биоплёнки во время инфекции человеческого тела. Традиционные MIC тестирования может не отражать концентрации, необходимые для искоренения бактерий в биопленки. Чтобы проверить влияние антибиотиков на биопленки, методы, основанные на биопленки биомассы, а т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грант от национального института здравоохранения д.х.н. и в.с. AI123340. Л-К.В, J.W., переменного тока, и е.н. были поддержаны в части/участие в программе «Первый год инноваций и исследований опыт», финансируемого университета штата Мэриленд. Спонсоры имел никакой роли в исследования дизайн, сбор данных и анализ, решение публиковать, или подготовка рукописи. Мы признаем UMD CBMG изображений ядра для всех экспериментов микроскопии.
Materials
| 100x Kellogg's supplement | |||
| Agar | United States Biological | A0930 | |
| BacTiter Assay | Promega | G8232 | |
| Ceftriaxone | TCI | C2226 | |
| Difco GC medium base | BD | 228950 | |
| Ferric nitrate, nonahydrate | Sigma-Aldrich | 254223-10G | |
| Glucose | Thermo Fisher Scientific | BP350-1 | |
| L-glutamine Crystalline Powder | Fisher Scientific | BP379-100 | |
| BacLight live/dead staining | Invitrogen | L7012 | |
| MS11 Neisseria gonorrhoeae strain | kindly provided by Dr. Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Research | ||
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | P290-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP329-1 | |
| Proteose Peptone | BD Biosciences | 211693 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S671-10 | |
| Soluble Starch | Sigma-Aldrich | S9765 | |
| Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754-5G | |
| Equipment | |||
| Petri Dishes | VWR | 25384-302 | |
| 8-well coverslip-bottom chamber | Thermo Fisher Scientific | 155411 | |
| 96-well tissue culture plates | Corning, Falcon | 3370 | |
| Biosafety Cabinet (NU-425-600 Class II, A2 Laminar Flow Biohazard Hood) | Nuaire | 32776 | |
| CO2 Incubator | Fisher Scientific | Model 3530 | |
| Confocal microscope equipped with live imaging chamber | Leica | SP5X | |
| Corning 96 Well Black Polystyrene Microplate | Corning | 3904 | |
| Glomax Illuminator | Promega | E6521 | |
| Pipette tips (0.1-10 µL) | Thermo Fisher Scientific | 02-717-133 | |
| Pipette tips (1000 µL) | VWR | 83007-382 | |
| Pipette tips (200 µL) | VWR | 53509-007 | |
| Spectrophotometer Ultrospec 2000 UV | Pharmacia Biotech | 80-2106-00 | |
| Sterile 15 ml conical tubes | VWR | 21008-216 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes (1.7 mL) | Sorenson BioScience | 16070 | |
| Sterile polyester-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-122 | |
| Sonicator | Kontes | Equivelent to 9110001 |
References
- den Heijer, C. D., et al. A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study. BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).
- Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents. The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).
- Hananta, I. P., et al. Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia. Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).
- Chlamydia, W. H. O. Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections. World Health Organisation. , (2011).
- Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. Diagnosis and management of gonococcal infections. American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).
- Alirol, E., et al. Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines. PLOS Medicine. 14 (7), (2017).
- Workowski, K. A., Bolan, G. A. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015. MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).
- Lahra, M. M., et al. Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain. Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).
- Wi, T., et al. Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action. PLOS Medicine. 14 (7), 1002344 (2017).
- Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents. Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).
- Greiner, L. L., et al. Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae. Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).
- Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies. Scientific Reports. 7 (1), (2017).
- Stein, D. C., et al. Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells. PLoS One. 10 (8), 0134342 (2015).
- LeVan, A., et al. Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes. Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O’Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Curr Protoc Microbiol. , (2005).
- Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates. Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).
- White, L. A., Kellogg, D. S. Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method. Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).
- Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns. Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).
- Herten, M., et al. Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces. Frontiers in Microbiology. 8, 2333 (2017).
- Gracia, E., et al. In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification. Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).
- Webb, J. S., et al. Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).
- Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. Journal of visualized experiments. (47), (2011).
- Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility. Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).
- Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).
- Hall-Stoodley, L., et al. Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).
