Post-larval 고기 분석 및 전체 마운트 Immunohistochemistry 멕시코 Tetra Astyanax mexicanus 를 높이

이 프로토콜에 걸쳐 설명 하는 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 하버드의과 대학에 의해 승인 되었습니다. 1입니다. 번 식 참고: 또한이 단계에서 사용 될 수 있는15,,1617,20 번 식에 대 한 여러 가지 게시 방법이 있다. 번 식, 이전 성인 물고기 10:14 빛: 다크 23 ° C에서 주기 및 먹이 펠 릿 다이어트에 유지 됩니다 (참조 테이블의 재료) 한 번 매일. 물고기는 기계적인 여과 및 UV 살 균 반복 시스템에서 자란 수 있습니다. 번 식 또한 정적 (비 재순환) 탱크, 수행 될 수 있습니다 하지만 물고기 하지 정적 탱크에 3 일 이상 그대로 두어야 수 질 신속 하 게 저하 됩니다. 물고기 준비 물 5 갤런 탱크를 채우기 (dechlorinated 물 조정: pH = 2, 전도도 + 7.1 150 µS, 온도 + 900 = = 23 ° C). 플라스틱 장소 메쉬 ( 자료참조)는 탱크의 바닥에. 정적 탱크에서 번 식 하는 경우 온수 탱크의 측면에 부착. 반복 시스템에서 사육 하는 경우 시스템 기름 통에 온수를 놓습니다.참고: 플라스틱 메쉬 계란 소비에서 성인을 방지할 수 있습니다. 장소 한 여자와 두 남자 A. mexicanus 는 탱크의 1 년 오래 된 보다 큰 물고기. 30 분에 대 한 적응을 물고기 허용. 24 ° C (또는 1 ° C 시작 온도 보다 따뜻한) 히터의 온도 설정 합니다. 24 시간 후 증가 온도 1 ° c. 24 시간 후 증가 온도 1 ° c. 탱크의 바닥에는 손전등 빛나는 여 매일 계란에 대 한 탱크를 확인 합니다. 두 일 동안 음식에서 물고기를 보류 합니다. 3 일 후 산란 하지 유도 하고있다, 히터를 해제 하 고 그들의 원래 탱크 물고기를 이동 하기 전에 실내 온도 (RT)로 돌아가려면 물 허용. 2. 해칭 수정 된 계란 계란 사육 탱크에 식별 되 면 성인과 플라스틱 메쉬를 제거 하 고 비 커 또는 컵을 사용 하 여 10 cm의 깊이에 물 감소.참고: 산란의 시간 추정, 페 트리 접시에 여러 계란을 배치 하 고14 단계 확인 하 고 수정 시간을 추정 하는 stereomicroscope에 그들을 볼을 전송 피 펫을 사용 합니다. 편리한 작업 표면에 탱크를 이동 하 고 불투명 한 계란 또는 탱크에만 반투명, 비옥한 계란을 떠나 배설물 제거.참고:이 시간에는 비옥한 계란 수를 기록할 수 있습니다. 물고기 준비와 탱크 (단계 1.1 참조) 물 및 물 채우고으로 탱크에 메 틸 렌 블루의 6-7 방울을 추가 작성.참고: 메 틸 렌 블루의 최종 농도 약 1.5 ppm 이다. 탱크 히터 및 수족관 bubbler (연결할 공기 펌프는 레 귤 레이 터)를 추가 합니다. 24 ° C에 히터를 설정 하 고 거품의 부드러운 흐름을 생산 하기 위해 airstream 레 귤 레이 터를 조정 합니다. 물 온도 유지 하기 위해 탱크에 커버를 놓습니다.참고: 계란의 산란 시간 24 시간 이내 부 화를 시작 한다. 3. 보육 컨테이너 부 화 애벌레의 전송 소금 20 g 추가 8 L의 물고기 준비 물 (단계 1.1 참조) 하 고 해산 때까지 휘저어 ( 자료참조). 각 1.5 L 보육 컨테이너 채우기 (참조 자료) 준비 물 1 리터와 함께. 전송 피 펫을 사용 하 여 컨테이너 당 20 물고기의 조밀도에 준비 보육 용기에 부 화 애벌레를 이동.참고: 헤드 램프 부 화 애벌레를 전송 하는데 유용할 수 있습니다. 모든 보이는 부 화 애벌레가 제거 된 후, 교 반, 또는에 가장자리와 모서리 피펫으로와 탱크의 물 제트기를 부 여 탱크에 물을 교 반 하십시오.참고:이 첫 번째 패스에 놓친 애벌레를 공개 도움이 됩니다. 지침의는 사무실의 실험실 복지 (OLAW)를 사용 하 여이 단계에서 사용 하지 않는 애벌레 폐기. 6.15%의 최종 농도 달성 하기 위해 탱크에 염소를 추가 합니다. 싱크대를 내리고 전에 적어도 5 분 기다립니다. 레이블 날짜 및 수정 시간 각 보육 컨테이너. 보육 컨테이너를 매일 볼 하 고 모든 죽은 애벌레를 제거 하려면 계속. 4.의 Rotifer 기반 물고기 음식 준비 Rotifers에 정보 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 설정, 유지, 수확 rotifers22을 참조 된 프로토콜을 따릅니다. 생선을 준비 해 조류 혼합의 3 mL를 추가 하 여 음식 ( 재료의 표참조) 수확된 rotifers의 1 l. 이 혼합물은 식량 공급으로 보육 용기에 직접 추가 됩니다. 5. 포스트 애벌레 물고기의 먹이 물고기 때 5 일 게시물 수정 (dpf), 각 보육 컨테이너 (4.2 단계에서 준비) 물고기 음식의 3 mL를 추가 합니다. 최적의 밀도에서 rotifers는 컨테이너의 중심에 보육 컨테이너의 모서리에 조밀한 그룹에 표시 하 고 덜 명백한 이어야 한다. 적절 한 밀도 도달할 때까지 추가 rotifer 혼합물을 추가 합니다. 매일 rotifers의 존재에 대 한 컨테이너를 확인 하 고 농도 고갈 되 면 더 추가. 어떤 죽은 애벌레를 제거를 계속 합니다. 물고기 14 dpf에 도달, 물 5 물고기/L의 조밀도에 반복 시스템에 맞게 탱크를 이동 합니다.참고: 포스트 애벌레 물고기를 살아 나 기의 수는이 시간에 기록할 수 있습니다. 6. 전체-마운트 Immunohistochemistry 후 애벌레 물고기의 붓는 보육 컨테이너는 나일론을 통해 물고기를 포함 하 여 24 시간에 대 한 음식에서 원하는 단계의 제거 후 애벌레 물고기 메쉬 스 트레이너 및 깨끗 한 생선 준비 물 컨테이너에는 스 트레이너를 배치 (단계 1.1 참조).참고: 모든 음식의 제거 필수적 이다. 도 적은 양의 음식에에서 자동 형광 고 이미징에 영향을 미칠 것 이다. 수집 하 고 물고기를 안락사.참고: 안락사 프로토콜 OLAW 지침을 따라야 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인을 받아야. 우리 tricaine 혼자 후 애벌레 물고기, 안락사 하지 않습니다 및 물고기는 물고기는 얼음에 또한 유지 되지 정착 액을 tricaine에서 전송 될 때 이동 하기 시작 지적 했다. 이온을 제거 된 물 1 l tricaine-S의 0.4 g, 나트륨 중 탄산염의 0.8 g을 추가 하 여 비 커에서 tricaine 솔루션을 준비 하 고 얼음에 그것을 배치. 물고기를 수집 하는 나일론 메쉬 스 트레이너를 통해 물고기를 포함 하는 물을 부 어. 부드럽게 차가운 Tricaine 솔루션에 스 트레이너를 잠수함과 10 분 동안 얼음에 그것을 두고. 안락사 물고기 수정. 잘라 팁 전송 피 펫을 사용 하 여 원뿔 관에 물고기를 전송. 전송 피 펫과 Tricaine 솔루션을 제거 하 고 정착 액을 바꿉니다. 락으로 품 어.참고: 정착 액 및 고정 시간 결정 되어야 합니다 사용 하는 항 체에 따라. 4 ° C에서 하룻밤 10% 포 르 말린 용액 (4% 포름알데히드, 참조 자료) 자료의 테이블에에서 나열 된 항 체에 대 한 적절 한입니다.주의: 포 르 말린은 유독 하 고 가연성. 개인 보호 장비 (장갑, 랩 코트, 그리고 스플래시 고글)을 착용 하 고 화학 후드에서 처리. 포 르 말린을 포함 하는 솔루션으로 유해 폐기물 처분 한다. 전송 피 펫을 사용 하 여 물고기를 방해 하지 않고는 정착 액을 조심 스럽게 제거. 3 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수-트리톤 솔루션 추가 [PBS와 0.1% 트리톤 (PBST), 참조 자료] 고 락을 함께 RT에서 15 분 동안 품 어. PBST를 제거 하 고 신선한 PBST 바꿉니다 “세척” 하나의 추가 시간 이것을 반복 하는 15 분 동안 품 어.참고: 물고기 몇 주 동안 4 ℃에서 0.02% 나트륨 아 지 드를 포함 하는 PBS에 저장할 수 있습니다. 전체-마운트 immunostaining를 수행 합니다. 차단 솔루션 [PB-0.5% 트리톤 X, 0.2% 소 혈 청 알 부 민 (BSA), 1% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), 0.02% 나트륨 아 지 드, 5% 당나귀 세럼] 50ml를 준비 합니다.주의: 나트륨 아 지 드와 DMSO 독성이 있다. 개인 보호 장비 (장갑, 랩 코트, 그리고 스플래시 고글) 처리할 때 사용 되어야 한다. 어떤 솔루션으로 유해 폐기물 처분 한다. 전송 피 펫을 사용 하 여 나사 가기 모자 4 mL 유리 유리병에 물고기를 전송. PBST를 제거 하 고 차단 솔루션 3 mL를 추가 전송 피 펫을 사용 합니다. 락으로 RT에 1 시간에 품 어. 전송 피 펫을 사용 하 여 차단 솔루션을 제거 하 고 기본 항 체 희석 솔루션을 차단에 추가. 동요와 함께 실 온에서 하룻밤를 품 어.참고: 예를 들어, 추가 안티-HuC/HuD 신경 단백질 마우스 단일 클론 항 체의 1: 250 희석 ( A. mexicanus에서 성공적으로 사용 된 항 체의 목록에 대 한 재료의 표 참조). 추가 없이 1 차 항 체로 물고기의 세트는이 단계에 포함 되어야 합니다. 항 체의 양을 충분히 커버 물고기 동요에 대 한 허용 해야 합니다. 6.3.4 단계에서 설명한 대로 3 번 PBST 물고기를 세척. 이차 항 체 솔루션을 차단에 희석 된 PBST를 대체 하 고 동요와 RT에서 밤새 품 어.참고: 최적의 차 및 2 차 항 체 농도, 보육 시간, 및 부 화 온도 각 항 체에 대 한 결정 되어야 합니다. RT에서 하룻밤 재료의 테이블에에서 나열 된 항 체에 대 한 효과적 이었습니다. 3 번과 PBST, 각 세척 단계 6.3.4에서에서 설명 된 대로 15 분을 지속 물고기를 세척. 해 부와 함께 진행 하기 전에 단기 저장용 PBS에 물고기를 전송 설치, 또는 물고기를 단면.