Anhebung der mexikanischen Tetra Astyanax Mexicanus für Analyse der Post-larval Phänotypen und vollständig-hängen Immunohistochemistry
Summary
In diesem Protokoll wir zeigen, wie Astyanax Mexicanus Erwachsene zu züchten, die Larven zu erhöhen, und ganze-Mount Immunohistochemistry auf Post-Larven Fische zu vergleichen die Phänotypen der Oberfläche und Höhle Morphotypen führen.
Abstract
Fluss und Höhle angepasste Populationen von Astyanax Mexicanus zeigen Unterschiede in der Morphologie, Physiologie und Verhalten. Forschung konzentrierte sich auf den Vergleich von adulten Forms hat die genetische Grundlage für einige dieser Unterschiede ergeben. Weniger bekannt ist, über die Unterschiede zwischen der Bevölkerungen bei Post-Larvenstadien (zu Beginn der Fütterung). Solche Studien können Einblick in wie Cavefish bis ins Erwachsenenalter in ihrer natürlichen Umgebung zu überleben. Methoden zum Vergleichen von Post-Larvalentwicklung im Labor erfordern standardisierte Aquakultur und Fütterung Regime. Hier beschreiben wir, wie Fisch auf eine Diät von nährstoffreichen Rädertierchen nicht Rezirkulation Wasser für bis zu zwei Wochen Post Befruchtung zu erhöhen. Wir zeigen, wie Post-Larven Fisch aus diesem Kindergarten-System zu sammeln und ganz-Mount Immunostaining durchführen. Immunostaining ist eine attraktive Alternative zu Transgen Expressionsanalyse für die Untersuchung von Entwicklung und Genfunktion in A. Mexicanus. Die Baumschule-Methode dient auch als ein standard-Protokoll für die Festlegung Dichte abgestimmt Bevölkerung Wachstum zu Erwachsenen.
Introduction
Die mexikanische Tetra ist Astyanax Mexicanus, einer einzigen Art von Fisch, die als Fluss lebende Populationen (Oberfläche Fisch) vorhanden ist und eine Reihe von höhlenbewohnenden Populationen (Cavefish) benannt nach den von die ihnen bewohnten Höhlen (d. h. Tinaja, Molino, Pachón). Eine wachsende Zahl der Forscher verwenden A. Mexicanus , um die genetischen und Entwicklungsstörungen Grundlagen der Verhaltenstherapie1,2,3,4, metabolische5,6 untersuchen ,7,8und morphologischen Evolution9,10,11. Verfügbare Ressourcen für Studien von A. Mexicanus gehören ein Genom sequenziert und annotiert12; Transkriptom-13; Developmental staging Tabelle14; und Methoden für die Zucht von15,16,17, Erstellen von gentechnisch veränderten Pflanzen18, und Gene19bearbeiten. Verbreitung von Zusatztools und aktualisierte Standardprotokolle beschleunigt Wachstum der Forschungsgemeinschaft Cavefish (siehe diese Methoden Sammlung20).
Unser Ziel ist es, um das bestehende Repertoire von Tools hinzufügen, indem Sie eine robuste Methode zur Bewertung von Gen-Aktivität in Situ in Post-Larven A. Mexicanus, in gewissem Sinne zwischen Labors vergleichbar. Es gibt zwei Herausforderungen zur Erreichung dieses Ziels. Erstens gibt es eine Notwendigkeit für standardisierte Regelungen für das Ausbrüten und erhöhen die Fische zwischen Labors, wie Unterschiede in den Parametern wie Fütterung und Dichte beeinflussen Wachstum und Reifung, damit Auswirkungen auf die Aktivität der Gene. Zweitens gibt es eine Notwendigkeit für eine standardisierte aber anpassungsfähige Methode für die Prüfung der Muster der Genaktivität in der Post-Larven Fisch. Wir gehen diesen Fragen hier, Einführung standard Praktiken zum Fisch zu Post-Larvenstadien anheben und eine robuste ganz-Mount Immunhistochemie (IHC) Protokoll für die Beurteilung der Genexpression in A. MexicanusEinführung.
Wir führen zunächst durch natürliche laichen die Fische züchten und befruchtete Eier zu identifizieren. Beschrieben weiter ist, wie man befruchtete Eier (Larven) schlüpfen und übertragen Sie sie auf Kindergarten Container, wo sie sind bei einer Dichte von 20 Fische pro Container für zwei Wochen gedacht ohne Rezirkulation oder das Wasser zu wechseln. Bei 5-Tage Post Befruchtung der Fisch entwickelt, um einen Post-Larvenstadien (nicht mehr mit einer Eigelb-Versorgung) und dienen als eine nährstoffreiche Nahrungsquelle, die keinen täglichen Nachschub benötigen Algen gefüttert Brachionus Plicatilis (Rädertierchen). Diese Methode bietet konsistente Wachstumsparameter für Larven und Post-larvale Entwicklung.
Genfunktion bewerten, demonstrieren wir entfernen die Fische vom Kindergarten Container und vollständig-hängen IHC durchführen. Die IHC-Methode vorgestellt wird von Protokollen entwickelt für den Einsatz mit Danio Rerio21 angepasst und ist wirksam für die Prüfung von Antigenen in allen A. Mexicanus Geweben getestet, einschließlich Gehirn, Darm und Bauchspeicheldrüse. IHC ist eine schnellere Alternative zur Erzeugung transgener Tiere zur Untersuchung der Genexpression und Protein-Lokalisierung. Dieses Protokoll wird für Studien, die darauf abzielen, A. Mexicanus wächst und vergleichen die Phänotypen der Oberfläche Fischen und Cavefish bei Post-Larvenstadien nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vergleich der Genaktivität zwischen Oberfläche und Höhle erfordert A. Mexicanus sorgfältig kontrollierten Umweltparameter und Methoden, die in Laboratorien repliziert werden können. Unser Protokoll für die Anhebung A. Mexicanus bietet konsistente Nährstoffgehalt während der Post-Larvalentwicklung. Im Anschluss an diese Fütterung kann Genfunktion souverän zwischen Populationen mit dem robusten Immunhistochemie Protokoll präsentieren wir verglichen werden. Hier besprechen wir die Bedeutung dieser Methode sowie seine Grenzen und zukünftige Anwendungen.
Um Dichte abgestimmt Wachstum zu erreichen, fanden wir, dass nach dem Larvenstadium Fisch ohne Rezirkulation Wasser für zwei Wochen im 1,5 L Container auf eine Diät von Rädertierchen angehoben werden kann. Dieses Protokoll kann auch verwendet werden, um Fische auf einem umlaufenden System zu erhöhen; Rädertierchen müssen jedoch täglich hinzugefügt werden, Ausgleich für die verlorenen durch den Tank-Abfluss. Frisch geschlüpfte Artemia -Nauplien werden häufig als Nahrungsquelle in der Aquakultur verwendet, aber wir fanden, dass die Verwendung von Rädertierchen hat erhebliche Vorteile, einschließlich: reduzierter Preis, verbesserte Biosicherheit, konsequente Ernährung und bessere Wasserqualität (siehe unten).
Erstens sind die wöchentlichen Kosten in Verbrauchsmaterialien 4 Dollar für Rädertierchen, im Vergleich zu 14 Dollar für Artemia. Über Biosicherheit, Rädertierchen sind unter kontrollierten Bedingungen im Labor angehoben, während Artemia werden gesammelt, aus der Natur und natürlichen Schwankungen in mikrobiellen oder Erreger Inhalt23. Darüber hinaus sind die Nährstoffzusammensetzung der Artemia Nauplien ökologisch entschlossen und daher unvereinbar. Nauplien gedeihen auf ihre eigenen Energiespeicher nach dem schlüpfen; Sie verlieren schnell Nährwert, wie sie sich entwickeln und optimal zu den Fischen innerhalb einiger Stunden gefüttert werden sollten. Artemia beginnen Fütterung an 12 Haus nach dem Schlupf, auf die das erste Mal, das sie ernährungsphysiologisch angereichert werden konnte; in diesem Stadium sind sie zu groß für 5 Dpf Fisch konsumieren geworden. Im Vergleich dazu fressen Rädertierchen kontinuierlich marine Mikroalgen, was zu hohen Nährstoffgehalt unabhängig davon, wann die Rädertierchen geerntet werden. Rädertierchen sind viel kleiner als Artmeia Nauplien (160 vs. 400 µm), so dass sie leichter für die Fische zu erfassen und zu schlucken. Nach dem Larvenstadium Oberfläche Fisch und Cavefish verbrauchen Rädertierchen in ähnlichen Mengen vorschlagen keinen Unterschied in der Bevorzugung oder Fähigkeit, die Rädertierchen10zu erfassen.
Schließlich beginnen Artemia Nauplien sterben in frischem Wasser mehrere Stunden nach eingeführt. Gefressenes Nauplien werden schwächer, die Wasserqualität rapide abnimmt, wenn sie nicht manuell entfernt werden. Entfernen von Toten Artemia ist zeitraubend und gefährlich für Post-Larven Fische, die sind nicht viel größer als Artemia und möglicherweise versehentlich entfernt oder verletzt. Rädertierchen können auf unbestimmte Zeit in den Kindergarten-Containern zu leben und Essen zu den Fischen jederzeit ohne Beeinträchtigung der Wasserqualität deutlich.
Während mit Rädertierchen, wie eine Nahrungsquelle erhebliche Vorteile hat, die Rädertierchen Lager, Algen halten das Kultursystem täglich hinzugefügt werden muss. Dies kann mit einem Futterautomaten, die flüssigen Algen in den Rädertierchen Kultur Behälter verzichtet (siehe Tabelle der Materialien). Rädertierchen müssen auch aus diesem Set-up alle 24-48 Stunden geerntet werden, um die Gesundheit der Kultur zu erhalten. Forscher, die Fische sehr selten (einmal jährlich, zum Beispiel) züchten und befassen sich nicht mit Vergleiche zwischen den Populationen an Post-Larvenstadien bevorzugen Artemia als Nahrungsquelle, da die verkapselten Embryonen jederzeit ausgebrütet werden können.
Es wird empfohlen, die Kontrollnummer des schraffierten und Überlebenden Larven der Erfolgskontrolle von Schlupf und das Wachstum. Wenn die meisten Embryonen oder Larven sterben, kann es durch bakterielle oder Pilzinfektionen Verschmutzung sein. Es wird empfohlen, die Wasserqualität des Fisch-Ready Wassers zu überwachen und keine Ausrüstung mit 70 % Ethanol zu sterilisieren. Kindergarten Container können wiederverwendet werden, nachdem sie gereinigt und sterilisiert werden. Um das Risiko einer Erkrankung zu minimieren, ist es auch entscheidend für jede Tote Fische aus den Kindergarten Behältern zu entfernen und Rädertierchen vor 5 Dpf nicht hinzufügen, wenn die Fische anfangen zu essen.
A. Mexicanus sind geschlechtsreif ca. ein Jahr alt. Dies ist eine Einschränkung für die Erzeugung von transgenen A. Mexicanus im Vergleich zu Danio Rerio (Zebrafisch), die bei 10-12 Wochen24züchten zu können. Immunhistochemie (IHC) ist eine alternative Methode, Genexpression und Protein Lokalisierung zu untersuchen. Das hier beschriebene Protokoll kann bei jedem Schritt angepasst und Antigene in jedem Gewebe des Interesses erkennen verwendet werden. Es ist wichtig, beachten jedoch, dass einige Gewebe möglicherweise schwieriger zu visualisieren in Oberfläche Fische durch Pigmentierung (eine Barriere, die in nichtpigmentierte Cavefish nicht vorhanden ist), welche die Interpretation vergleichender Studien beeinflussen können. Um dieses potentielle Problem zu beheben, kann Oberflächen Fisch Pigment nach der Fixierung mit 3 % Wasserstoffperoxid gebleicht werden.
IHC erfordert erfolgreiche Gewebe Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen. Methoden für jeden je nach Gewebe und Protein des Interesses. Das Fixiermittel und Fixierung Mal muss Zellarchitektur beibehalten, unter Beibehaltung der Antigen-Epitop. Für dieses Protokoll wir verwenden eine vernetzende Fixativ (Paraformaldehyd) und Weglassen einer denaturierenden Fixativ (z. B. Methanol oder Aceton). Wir fanden, dass Inkubation in Aceton Antikörper Signal für neuronale und Pankreas Marker vermindert. Die blockierende Schritt unbedingt Antikörper aus der Bindung auf Nichtziel-Proteine im Gewebe zu verhindern. Diese Methode verwendet eine Kombination aus normalen Serum (5 %) und BSA (0,2 %) in der blockierenden Lösung. Die blockierende Lösung enthält Antikörper und Proteine, die an reaktiven Zentren auf Proteine im Gewebe, Verminderung der unspezifischen Bindung der primären und sekundären Antikörper binden.
Um Antikörper Marktdurchdringung zu erreichen, muss das Gewebe permeabilized. Dies lässt sich mit Reinigungsmitteln oder denaturierenden Lösungsmittel aber muss optimiert werden, um die Antigen-Epitop zu bewahren. Unser Protokoll verwendet eine Kombination von Triton und Dimethyl Sulfoxid (DMSO). Triton und DMSO sind jeweils während der Sperrung und Antikörper Inkubationszeit Schritte bei Konzentrationen von 0,5 % und 1 % enthalten. Mit dieser Konzentration, haben wir beobachtet Färbung im Gehirn, Bauchspeicheldrüse, Darm und Muskeln, was darauf hindeutet, dass es wahrscheinlich effektiver für die Durchdringung aller Gewebe ist. Fischgröße kann eindringen auch beeinflusst werden. Dieses Protokoll wurde nicht auf Fische, die größer als 14 Tage alt (ca. 7 mm in der Länge) getestet. Um Fleckenbildung zu beheben, empfiehlt es sich, die Fixierung, blockieren und Antikörper eindringen Schritte ändern. Es ist auch wichtig, die Reihenfolge Erhaltung die Immunogen mit A. Mexicanus Proteins des Interesses unter Verwendung der verfügbaren Genom-25zu untersuchen.
A. Mexicanus ist ein hervorragendes Modell, Entwicklung zu untersuchen, wie Populationen der gleichen Art, die in völlig unterschiedlichen Umgebungen entwickelt haben im Labor direkt verglichen werden können. Standard Tierhaltung Protokolle, sowohl innerhalb als auch zwischen Labors, sind für das Verständnis der biologischen Unterschiede zwischen Oberfläche Fisch und Cavefish. Unsere Artikel stellt eine Methode zur Entwicklung und Genaktivität in Post-Larven Fische ausgesetzt, stetiges Wachstumsparameter zu untersuchen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materials
| methylene blue | Kordon | B016CBHZUS | antifungal |
| heater | Finnex | 4711457836017 | 100W Digital Control Heater |
| airstone | Lee's Aquarium & Pet Products | 10838125202 | disposable air stone |
| salt | Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt |
| nursery container | IPC | 21545-002 | 40 oz or 1.5 L clear containers |
| transfer pipette | VWR | 414004-002 | plastic bulb pipettes |
| compact culture system(CCS) starter kit with Brachionus plicatilis (L-type) rotifers | Reed Mariculture | na | fish food |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 oz bottle of rotifer food |
| Programmable Auto Dosing Pump DP-4 | Jebao | DP-4 | automatic feeder for rotifers |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | fish anesthetic |
| sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | for tricane solution |
| nylon mesh strainer | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | 3-inch diameter |
| Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | fixative |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | buffer, dilute to 1X using distilled water |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002-25G | anti-bacterial |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9647-100G | blocking reagent |
| glass vial with screw-top cap 4mL | Wheaton | 224742 | staining vial |
| plastic mesh screen for breeding tank | Pentair | N1670 | Cut into a rectangle 6mm larger on all edges than the dimensions of the bottom of the breeding tank. Cut a 6mm square from each corner of the rectangle. Bend the edges of the screen down along all four edges.Place a pair of 6mm vinyl-coated disk magnets on either side (top and bottom) of the mesh on each corner. The screen should be as snug as possible to the sides of the tank. The screen can be removed from the tank with a metal fish net. |
| vinyl-coated disk magnets | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A pellet fish food | New Life International | na | Adult fish food. A list of retailers for this product is available on the company website |
| Antibodies | |||
| insulin antibody from guinea pig | Dako | A0564 | 1:200 |
| glucagon antibody from sheep | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylated tubulin antibody from mouse | Sigma | T6793 | 1:500 |
| HuD/HuC antibody from mouse | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| nitric oxide synthase (nNOS) antibody from rabbit | Abcam | ab106417 | 5μg/mL |
| choline acetyltransferase (ChAT) from rabbit | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonin (5HT) from rabbit | Immunostar | 20080 | 1:500 |
References
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