心脏细胞治疗中干细胞 dna 完整性的评估
Summary
在这里, 我们提供了一个实验设置的详细描述, 用于分析细胞移植前干细胞 dna 完整性的评估。
Abstract
干细胞和干细胞衍生细胞作为各种退行性疾病的再生治疗具有巨大的潜力。dna 是包括干细胞在内的所有细胞中基因数据的仓库, 其完整性是其再生能力的基础。干细胞在实验室中迅速繁殖, 以获得移植所需的数量。加速细胞生长会导致积累的代谢物 (如活性氧、碳基和烷基化剂) 失去 dna 完整性。移植这些细胞会导致移植不良和器官再生恶化。此外, 移植 dna 受损的细胞会导致突变、dna 不稳定、细胞衰老, 并可能导致癌症等危及生命的疾病。因此, 迫切需要一种质量控制方法来评估细胞是否适合移植。在这里, 我们提供了评估干细胞在细胞移植之前 dna 完整性的分步协议。
Introduction
实验和临床证据表明, 细胞移植能适度改善衰竭心脏1、2、3、4、5的左心室收缩性能 ,6,7,8,9。最近的进展为心血管再生提供了进一步的吸引人的机会;这些包括在体细胞中强制表达重编程因子, 以诱导多能性, 并将这些诱导的多能干细胞 (ipsc)分化为不同的心脏谱系, 重要的是心肌细胞 (cm)10,11,12,13. 每个细胞的遗传物质, 包括人工生成的 ipscs 和 ipsc 衍生 cm (ips-cm), 都是 dna。存储在 dna 中的基因指令决定了细胞、组织、器官和生物的生长、发育和功能。dna 不是惰性的;细胞代谢物, 如活性氧、碳基和氮以及烷基化剂, 可在体外和体内造成dna 损伤 14、15、16、17。重要的是, dna 损伤直观地发生在每个细胞中, 频率很高。如果这些损害得不到纠正, 将导致 dna 突变、细胞衰老、dna 和细胞完整性的丧失, 以及可能的疾病, 包括危及生命的癌症。因此, 保留 dna 完整性对于任何在临床中具有巨大潜力的细胞, 尤其是 ipsc 来说都是必不可少的。
为了评估分离基因组 dna 的数量和完整性, 市场上有昂贵的设备。然而, 没有简单和具有成本效益的方法来评估 dna 完整性的细胞, 而不分离细胞。此外, 用户在 dna 分离过程中诱导的 dna 降解是使用这些方法的主要缺点之一。单细胞凝胶电泳 (称为彗星检测)18,19和γh2a. x 免疫标记8技术是评估 dna 损伤的研究实验室的基本方法。这两种方法不需要昂贵的设备或分离的基因组 dna 来分析 dna 完整性8,20,21。自那时以来, 这些技术已经执行了整个细胞;用户诱导的 dna只能在样品制备过程中降解 dnaa/rna 蛋白不会影响这些协议。在这里, 为了评估干细胞和干细胞中的 dna 损伤和 dna 损伤反应, 我们提供了一步一步的协议来执行彗星分析和γh2a. x 免疫标记。此外, 结合这两种方法, 我们提出了一个天真的评估, 可用于评估细胞是否适合移植。
彗星检测, 或单细胞凝胶电泳, 测量细胞中的 dna 断裂。对低熔融琼脂糖中的细胞进行裂解, 形成含有超盘绕 dna 的核。电泳后, 小块破碎的 dna 和破碎的 dna 链通过琼脂糖毛孔迁移, 而完整的 dna, 由于它们的巨大大小和它们与基质蛋白的结合, 将有一个受限制的迁移。荧光显微镜下染色 dna 的图案模仿彗星。彗星头包含完整的 dna, 尾巴由片段和破碎的 dna 链组成。dna 损伤的分数可以通过受损 dna (彗星尾部) 相对于完整的 dna (彗星头) 强度的荧光强度来测量。参数尾矩可以计算, 如图 1所示。
dna 损伤诱导组蛋白 h2a 的磷酸化。x (γh2a. x) 在 ser139 通过 atm、atr 和 dna-pk 激酶。h2a 的磷酸化和招募。x 在 dna 链断裂被称为 dna 损伤反应 (ddr), 并在 dna 损伤后迅速发生。在这一过程之后, 开始了检查点介导的细胞周期抑制和 dna 修复过程。成功完成 dna 修复后, γh2a. x 被磷酸化并通过磷酸酶灭活。长的多个 dna 链断裂导致在 dna 中积累γh2a. x 病灶。这表明细胞无法修复 dna 损伤和 dna 完整性的丧失。dna 中的这些γh2a. x 病灶可以通过第2部分中的协议进行识别, 并可以使用第2节中的协议计算 ddr 病灶的数量。
Protocol
Representative Results
Discussion
dna 完整性描绘了细胞的完整性。dna 受损的细胞经常处于压力状态, 最终失去完整性。为移植目的而繁殖的干细胞和干细胞的完整性是细胞履行其所需功能的主要原因。移植 dna 受损的细胞会导致8,20细胞的移植率和性能较差。因此, 在细胞移植前检查 dna 完整性是一种必要的质量控制方案。在这里, 我们描述了两种具有成本效益的方法, 即彗星检测和γh2a. x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了国家心脏组织的部分支持, 肺和血液研究所授予 ro1-hl-999507、hl-114120、hl-131017、hl138023 和 uo1-hl-134764 (致 j. zhang) 和美国心脏协会科学发展赠款 17sdg33670677 (至 r. kannappan)。
Materials
| 0.25% Trypsin | Corning | 25200056 | |
| 8-well chamber slide | Millicell | PEZGS0816 | |
| Accutase | Stemcell Technologies | 7920 | Cell detachment solution |
| Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG |
Jackson Immuno Research Laboratories |
711-545-152 (RRID: AB_2313584) |
|
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson Immuno Research Laboratories |
711-165-152 (RRID:AB_2307443) |
|
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| Gibco B-27 Supplement, Serum Free, | Gibco | 17504-044 | |
| Matrigel growth factor reduced | Corning | 354230 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| PhalloidinA488 | Life Technology | A12379 | |
| Phospho-Histone H2A.X (Ser139) Antibody | Cell Signaling Technology | 2577 (RRID: AB_2118010) | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| SYBR Green I nucleic acid gel stain | Sigma-Aldrich | S9430 | |
| Triton X-100 | Fisher scientific | BP151-100 | |
| UltraPure Low melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | Antifade |
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