Rab10 인산화를 평가하여 파킨슨병 관련 LRRK2 키나아제 경로를 심문하기 위한 인간 말초 혈액 호중구 격리
Summary
류신이 풍부한 반복 키나아제 2 유전자(LRRK2)의 돌연변이는 유전성 파킨슨병을 일으킨다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에서 Rab10의 LRRK2 대조 인산화를 평가하기위한 쉽고 강력한 방법을 개발했습니다. 이 증가 LRRK2 키 나 제 통로 활동을 가진 개인을 식별 하는 데 도움이 수 있습니다.
Abstract
류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)는 유전성 파킨슨병(PD)에서 가장 빈번하게 돌연변이되는 유전자이며 모든 병원성 LRRK2 돌연변이는 키나아제 기능의 과활성화를 초래한다. 여기서, 우리는 그것의 생리적 기질 중 하나인 Rab10을 트레오닌 73에서 LRRK2 대조 포스포릴화를 측정함으로써 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 키나아제 통로 활성을 정량화하는 쉽고 강력한 분석방법을 기술한다. 기재된 면역블로팅 분석은 MJFF-pRab10 토끼 모노클로날 항체와 같은 LRRK2에 의해 인산화된 Rab10 Thr73 에피토프를 인식하는 완전 선택적 및 인광특이적 항체를 필요로 한다. 말초 혈액은 쉽게 접근 할 수 있고 호중구는 풍부하고 균일 한 구성 요소이기 때문에 인간의 말초 혈액 호중구를 사용합니다. 중요한 것은, 호중구는 LRRK2와 Rab10 둘 다의 상대적으로 높은 수준을 표현합니다. 호중구의 잠재적인 단점은 그들의 높은 본질적인 세린 프로테아제 활성, 유기 인스포러스 신경 독소 디이소프로필플루오로프포스산염 (DIFP)와 같은 매우 강력한 프로테아제 억제제의 사용을 필요로 하는 리시저 완충제의 일부입니다. 그럼에도 불구하고, 호중구는 생체 내에서 LRRK2 키나아제 통로 활성에 대한 연구를 위한 귀중한 자원이며 PD 생체 저장소 컬렉션에 포함시키는 것으로 고려되어야 한다.
Introduction
파킨슨 병 (PD)을 늦추거나 멈추려는 시도는 지금까지 실패했습니다. 류신이 풍부한 반복 키나아제 2(LRRK2)에서 의한 과다 활성화 돌연변이의 발견은 PD에 대한 위험을 증가시키고 있거나 증가시키는 LRRK2 키나아제 억제제1,,2,,3의발달로 이어졌다. 이들은 지금 임상 시험4를입력했습니다. LRRK2의 정확한 기능은 불분명하지만, 주요 발전은 LRRK2 키나제,5,6,7의첫 번째 보나 피라제 생리기로서 Rab10을 포함하는 랍 GTPase 단백질의 서브세트의 식별이었다.7 질병 변형 치료제의 시대에 주요 과제는 LRRK2 키나아제 활성화 상태의 생화학적 마커및 LRRK2 키나제 억제제의 표적 결합이다.
지금까지, 생체 내 LRRK2 억제제의 주요 약동학 마커는 LRRK2의 구성적으로 인산화된 세린 잔기의 클러스터였으며, 특히 세린 935는 다양한 LRRK2억제제8,,9에반응하여 탈인성화된다. 그러나, 세린 935 인산화는 LRRK2에 의해 직접적으로 인산화되지 않고 여전히 키나제 비활성LRRK2(10)에서인산화되지 않기 때문에 본질적인 세포 LRRK2 키나아제 활성과 상관관계가 없다. LRRK2 키나아제 활성은 세린(1292)의 오토포스포릴레이션과 잘 상관되지만, 본부위에,대한 신뢰할 수 있고 인특이적인 항체의 현재 부족으로 인해 전체 세포 추출물의 면역블롯 분석에 의한 내인성 LRRK2 키나아제 활성에 대한 적절한 판독은 실질적으로아니다.
우리는 스레오닌 7311에서LRRK2 대조 단백질 Rab10의 생리적 표적 인산화를 측정하는 인간 말초 혈액 세포에서 LRRK2 키나아제 경로 활성을 정량화하는 강력하고 쉬운 분석방법을 개발했습니다. 말초 혈액은 최소한의 불편을 일으키는 원인이 되는 낮은 리스크 그리고 빠른 절차인 베니섹션에 의해 쉽게 접근할 수 있습니다. 우리는 인간 말초 혈액 호중구에 초점을 맞추기 때문에 그들은 풍부 (모든 백혈구의 37-80%)와 LRRK2와 Rab1011둘 다의 상대적으로 높은 수준을 발현하는 균질한 세포 인구. 더욱이, 말초 혈액 호중구는 면역자기 음성 접근법을 채택하여 신속하고 효율적으로 단리될 수 있다. 후속 관찰된 Rab10 인산화가 LRRK2에 의해 매개되도록 하기 위해, 호중구의 각 배치는 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제의 유무에 관계없이 배양된다(MLi-2를 사용하고 권장한다)2,,12. 이어서 프로테아제 억제제 디이소프로필 플루오로포스페이트(DIFP)를 함유하는 완충제에서 세포 용해가 이어서호중구(13)에서높은 것으로 알려진 본질적인 세린 프로테아제 활성을 억제하는 데 필요하다. 정량적 면역블로팅에 의한 최종 분석을 위해, Rab10 Thr73-phoepitope를 특이적으로 검출하고 다른 인산화 된 랍 단백질(14)과교차 반응하지 않는 MJFF-pRab10 토끼 단클론 항체를 사용하는 것이 좋습니다. 이 항체의 선택성 및 특이성은 상이한 랍 단백질 및 A549 Rab10 녹아웃세포주(14)의과발현 모델에서 검증되었다. 따라서, 강력하고 선택적인 LRRK2 키나아제 억제제2를이치에 없이 처리된 호중구 매립제에서 Rab10 인산화의 차이를 측정한다. 양자택일로, 견본은 또한 정량 질량 분석과 같은 그밖 방법에 의해 분석될 수 있었습니다.
결론적으로, LRRK2 대조군 Rab10 인산화는 세린 935및 인간 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 인산화에 LRRK2 키나아제 활성의 우수한 마커이며, 인간 말초 혈액 호중구는 LRRK2에 대한 PD 연구에 귀중한 자원이다. 당사의 프로토콜은 말초 혈액 호중구에서 LRRK2 경로 활성을 심문하는 강력하고 쉬운 분석을 제공하고 증가된 LRRK2 키나아제 활성15를가진 개인의 생화학적 계층화를 허용한다. 중요하게는, 그러한 개인은 향후 LRRK2 키나아제 억제제 치료로부터 혜택을 받을 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
강력한 임상, 유전 및 생화학적 증거는 LRRK2및 특히 파킨슨 병에서 의 키나아제 기능에 대한 중요한 역할을지적7. LRRK2 키나아제 억제제가 개발되어 임상 시험2,,4,,12에진입하고 있다. 이와 같이 LRRK2를 환자 계층화뿐만 아니라 표적 참여에 대한 바이오마커로 활용할 필요성이 있다. 당사의 프로토콜은 인간 말?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구를 위해 혈액을 기증해 주신 건강한 자원봉사자들에게 감사드립니다. 마이클 J. 폭스 파킨슨 연구 재단(MJFF)과 폭스 바이오넷 연구 리더십(FBN)이 서면 프로토콜과 비디오에 대한 지원과 의견을 제시해 주신 것에 대해 감사드립니다. 오스트리아 비엔나 대학의 알렉산더 질프리치 교수님이 당사의 프로토콜과 협업을 테스트해 주신 것에 대해 감사드립니다. 우리는 프로젝트 (MRC PPU의 일반 관리자)에 폴 데이비스의 기여를 소중히. 우리는 또한 MRC 단백질 인산화 및 유비퀴틸화 유닛 (PPU) 즉 화학 합성 (MLi-2 합성을위한 나탈리아 슈피로), MRC PPU 시약 및 서비스 항체 정제 팀의 우수한 기술 지원을 인정합니다 (에 의해 조정됨) 힐러리 맥라우클란과 제임스 하스티). 우리는 비디오와 애니메이션을 만드는 데 도움을 비보 모션에서 Mhairi 토울러와 프레이저 머독에게 감사드립니다. 81편의 영화에서 스티브 소아브(Steve Soave)가 최종 편집에 도움을 주신 것에 대해 감사드립니다. 에스더 샘러는 스코틀랜드 수석 임상 학술 펠로우십의 지원을 받고 있으며 파킨슨 병의 영국 (K-1706)으로부터 자금을 지원받았습니다.
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
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