Rab10リン酸化を評価してパーキンソン病関連LRRK2キナーゼ経路を尋問するためのヒト末梢血好中球分離

パーキンソン病(PD)を遅くまたは停止する試みは、これまでのところ失敗しています。PDのリスクを引き起こすおよび/または増加するロイシンリッチリピートキナーゼ2(LRRK2)における過剰活性化突然変異の発見は、LRRK2キナーゼ阻害剤^{11、2、32,3}の開発につながっている。これらは今臨床試験⁴に入りました。LRRK2の正確な機能は不明であるが、大きな進歩は、LRRK2キナ^{ーゼ5、6、7,6,7}の最初のボナフィデス生理基質としてRab10を含むRab GTPaseタンパク質のサブセットの同定であった。疾患修飾治療の時代における主な課題は、LRRK2キナーゼ活性化状態の生化学的マーカーおよびLRRK2キナーゼ阻害剤の標的関与である。

これまで、インビボにおけるLRRK2阻害剤の主な薬物動態マーカーは、LRRK2の構成的にリン酸化されたセリン残基のクラスターであり、特にセリン935は、多様なLRRK2阻害剤^88,99に応答して脱リン酸化される。しかしながら、セリン935リン酸化は、LRRK2によって直接リン酸化されておらず、キナーゼ不活性LRRK2¹⁰中に依然としてリン酸化されているため、固有の細胞LRRK2キナーゼ活性と相関しない。LRRK2キナーゼ活性はセリン1292の自己リン酸化とよく相関するが、実際には、この部位^10,11,11に対する信頼できる、そしてホスホ特異的抗体の現在の欠如による全細胞抽出物の免疫ブロット分析による内因性LRRK2キナーゼ活性に適した読み出しではない。

我々は、ヒト末梢血細胞におけるLRRK2キナーゼ経路活性を定量化するための堅牢で容易なアッセイを開発し、その生理学的標的タンパク質Rab10のリン酸化をスレオニン⁷³¹¹で測定した。末梢血は、最小限の不快感を引き起こす低リスクかつ迅速な手順である静脈切除によって容易にアクセス可能である。ヒト末梢血好中球は、LRRK2とRab10¹¹の両方の比較的高いレベルを発現する豊富な(全白血球の37~80%)と均質な細胞集団を構成するため、我々は注目する。さらに、末梢血好中球は、免疫磁気陰性アプローチを採用することにより、迅速かつ効率的に単離することができる。その後観察されたRab10リン酸化がLRRK2によって媒介されることを確実にするために、好中球の各バッチは、強力で選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤の有無にかかわらずインキュベートされる(我々はMLi-2を使用し、推奨する^{)2、12。,12}この後、プロテアーゼ阻害剤ジイソプロピルフルオロリン酸塩(DIFP)を含む緩衝液中の細胞溶出が続き、好中球¹³において高くすることが知られているセリンプロテアーゼ活性を抑制するために必要である。定量免疫ブロット法による最終分析では、Rab10 Thr73-ホスホエピトープを特異的に検出し、他のリン酸化ラブタンパク質¹⁴と交差反応しないMJFF-pRab10ウサギモノクローナル抗体を用いることにお勧めします。この抗体の選択性と特異性は、異なるRabタンパク質の過剰発現モデルおよびA549 Rab10ノックアウト細胞ライン¹⁴において検証されている。従って、強力かつ選択的なLRRK2キナーゼ阻害剤²の有無にかかわらず治療された好中球の溶血体におけるRab10リン酸化の差を測定する。あるいは、定量質量分析などの他の方法によってサンプルを分析することもできる。

結論として、LRRK2制御のRab10リン酸化は、セリン935におけるLRRK2リン酸化に対するLRRK2キナーゼ活性の優れたマーカーであり、ヒト末梢血好中球は、LRRK2に関するPD研究の貴重なリソースである。我々のプロトコルは、末梢血好中球中のLRRK2経路活性を問い合わすために堅牢で容易なアッセイを提供し、LRRK2キナーゼ活性¹⁵を増加した個体の生化学的階層化を可能にする。重要なことに、このような個体は、将来のLRRK2キナーゼ阻害剤治療の恩恵を受ける可能性がある。