الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور
Summary
الطفرات في الليوسيني الغنية تكرار جين كيناس 2 (LRRK2) تسبب مرض باركنسون الوراثية. لقد طورنا طريقة سهلة وقوية لتقييم الفوسفور الذي يسيطر عليه LRRK2 من Rab10 في العدلات الدم المحيطية البشرية. وهذا قد يساعد على تحديد الأفراد مع زيادة نشاط مسار كيناز LRRK2.
Abstract
الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) هو الجين الأكثر تحور في كثير من الأحيان في مرض باركنسون الوراثية (PD) وجميع الطفرات LRRK2 المسببة للأمراض يؤدي إلى فرط تنشيط وظيفتها كيناز. هنا، ونحن نصف قياس سهلة وقوية لقياس نشاط مسار كيناز LRRK2 في العدلات الدم المحيطية البشرية من خلال قياس الفوسفور LRRK2 التي تسيطر عليها واحدة من ركائزها الفسيولوجية، Rab10 في threonine 73. يتطلب تحليل المناعي الموصوف جسمًا مضادًا انتقائيًا وفوسفومحددًا تمامًا يتعرف على فوسفور epitope Rab10 Thr73 الذي سجله LRRK2 ، مثل الأجسام المضادة أحادية النسيلة من نوع MJFF-pRab10. ويستخدم العدلات الدم المحيطية البشرية, لأن الدم المحيطي يمكن الوصول إليها بسهولة والعدلات هي مكون وفيرة ومتجانسة. الأهم من ذلك، العدلات التعبير عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab10. عيب محتمل من العدلات هو نشاطها البروتياز سيرين الجوهرية العالية، مما يتطلب استخدام مثبطات البروتياز قوية جدا مثل السم العصبي العضوية diisopropylfluorophosphate (DIFP) كجزء من المخزن المؤقت الزل. ومع ذلك، فإن العدلات هي مورد قيم للبحث في نشاط مسار LRRK2 كيناز في الجسم الحي وينبغي النظر في إدراجها في مجموعات مستودعات PD الحيوية.
Introduction
فشلت محاولات إبطاء أو وقف مرض باركنسون (PD) حتى الآن. اكتشاف طفرات فرط التنشيط في الليوسين الغنية تكرار كيناز 2 (LRRK2) التي تسبب و / أو زيادة خطر PD أدى إلى تطوير مثبطات كيناز LRRK21،2،3. وقد دخلت هذه الآن التجارب السريرية4. وظيفة بالضبط من LRRK2 غير واضح، ولكن التقدم الرئيسي كان تحديد مجموعة فرعية من البروتينات راب GTPase، بما في ذلك Rab10، كأول ركائز الفسيولوجية حسن النية من كيناز LRRK25،6،7. التحديات الرئيسية في عصر العلاجات تعديل الأمراض هي العلامات الكيميائية الحيوية لحالة تنشيط الكيناز LRRK2 والمشاركة المستهدفة من مثبطات كيناز LRRK2.
حتى الآن، العلامة الدوائية الرئيسية لمثبطات LRRK2 في الجسم الحي كانت مجموعة من بقايا سيرين الفوسفورية التأسيسية من LRRK2، ولا سيما سيرين 935، التي تصبح dephosphorylated استجابة لمثبطات LRRK2 المتنوعة8،,9. ومع ذلك، سيرين 935 الفوسفور لا يرتبط مع نشاط الكيناز الخلوي الجوهري LRRK2 لأنه ليس الفوسفوري مباشرة من LRRK2 ولا يزال الفوسفورفي الكيناس غير نشط LRRK210. LRRK2 نشاط كيناز يرتبط بشكل جيد مع الفوسفور التلقائي من سيرين 1292، لكنه من الناحية العملية ليست قراءة مناسبة لنشاط LRRK2 كيناز الذاتية من خلال تحليل immunoblot من مقتطفات الخلية بأكملها بسبب عدم وجود الأجسام المضادة موثوق بها وفوسفومحددة لهذا الموقع10،11.
لقد قمنا بتطوير قياس قوي وسهل لقياس نشاط مسار الكيناز LRRK2 في خلايا الدم المحيطية البشرية التي تقيس الفوسفور الذي تسيطر عليه LRRK2 من البروتين المستهدف الفسيولوجي Rab10 في threonine 7311. يمكن الوصول إلى الدم المحيطي بسهولة عن طريق venesection ، وهو إجراء منخفض الخطورة وسريع يسبب الحد الأدنى من عدم الراحة. نحن نركز على العدلات الدم المحيطية البشرية لأنها تشكل وفرة (37-80٪ من جميع خلايا الدم البيضاء) وخلايا متجانسة السكان التي تعبر عن مستويات عالية نسبيا من كل من LRRK2 وRab1011. وعلاوة على ذلك، يمكن عزل العدلات الدم المحيطية بسرعة وكفاءة من خلال استخدام نهج سلبي مغناطيسي مناعية. لضمان أن يتم التوسط في الفوسفور Rab10 لوحظ اللاحقة من قبل LRRK2، يتم احتضان كل دفعة من العدلات مع أو بدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية (نستخدم ونوصي MLi-2)2،,12. ثم يتبع ذلك الانزلات الخلوي في عازل يحتوي على البروثيديفوسفوسفوسفلور ثنائي البروبروبروبيل (DIFP)، وهو أمر ضروري لقمع نشاط البروتياز الرِسيّ الجوهري المعروف أنّه مرتفع في العدلات13. للتحليل النهائي عن طريق المناعي الكمي، نوصي باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة MJFF-pRab10 الأرنب الذي يكشف على وجه التحديد Rab10 Thr73-phosphoepitope ولا عبر التفاعل مع البروتينات راب الفوسفورية الأخرى14. وقد تم التحقق من صحة الانتقائية وخصوصية هذا الأجسام المضادة في نماذج الإفراط في التعبير من البروتينات راب مختلفة وA549 Rab10 ضرب خارج خط الخلية14. وهكذا، فإننا قياس الفرق في الفوسفور Rab10 في العدلات التي تم التعامل معها مع وبدون مثبط كيناس LRRK2 قوية وانتقائية2. وبدلاً من ذلك، يمكن أيضاً تحليل العينات بأساليب أخرى، مثل قياس الطيف الكمي للكتلة.
في الختام، LRRK2 التي تسيطر عليها Rab10 الفوسفور هو علامة متفوقة من نشاط كيناز LRRK2 إلى الفوسفور LRRK2 في سيرين 935 والبشر العدلات الدم المحيطية هي مورد قيمة لبحوث PD في LRRK2. بروتوكوللدينا يوفر فحص قوي وسهل لاستجواب نشاط مسار LRRK2 في العدلات الدم المحيطية ويسمح الطبقية الكيميائية الحيوية للأفراد مع زيادة LRRK2 نشاط كيناز15. الأهم من ذلك، قد يستفيد هؤلاء الأفراد من العلاج مثبطات الكيناز LRRK2 في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تشير الأدلة السريرية والوراثية والبيوكيميائية المقنعة إلى دور مهم لـ LRRK2 وخاصة وظيفتها في kinase في مرض باركنسون7. وقد وضعت مثبطات كيناز LRRK2 وتدخل التجارب السريرية2,,4,,12. على هذا النحو هناك حاجة لاستغلال LRRK2 كعلامة بيولوجية للمشا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر المتطوعين الأصحاء الذين تكرموا بالتبرع بالدم لهذه الدراسة. نشكر مؤسسة مايكل ج. فوكس لأبحاث باركنسون (MJFF) وقيادة دراسة فوكس بيوتنت (FBN) على دعمهما ومدخلاتهما نحو البروتوكول المكتوب والفيديو. ونشكر البروفيسور ألكسندر زيمبريتش من جامعة فيينا في النمسا على اختبار بروتوكولنا وتعاوننا. نحن نقدر مساهمات بول ديفيز في المشروع (المدير العام لـ MRC PPU). ونحن ندرك أيضا الدعم التقني الممتاز من MRC البروتين الفوسفور ووحدة ubiquitylation (PPU) وهي التركيب الكيميائي (ناتاليا Shpiro لتجميع MLi-2)، MRC PPU الكواشف والخدمات فرق تنقية الأجسام المضادة (منسقة من قبل هيلاري ماكلوشلان وجيمس هاستي). نشكر مهيري تاولر وفريزر مردوخ من Vivomotion لمساعدتهما في صناعة مقاطع الفيديو والرسوم المتحركة. نشكر ستيف سواف من 81 فيلما للمساعدة في التحرير النهائي. يتم دعم استير ساملر من قبل الزمالة الأكاديمية السريرية العليا الاسكتلندية وتلقت التمويل من باركنسون في المملكة المتحدة (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
References
- Paisan-Ruiz, C., et al. Cloning of the gene containing mutations that cause PARK8-linked Parkinson’s disease. Neuron. 44 (4), 595-600 (2004).
- Fell, M. J., et al. MLi-2, a Potent, Selective, and Centrally Active Compound for Exploring the Therapeutic Potential and Safety of LRRK2 Kinase Inhibition. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 397-409 (2015).
- Zimprich, A., et al. Mutations in LRRK2 cause autosomal-dominant parkinsonism with pleomorphic pathology. Neuron. 44 (4), 601-607 (2004).
- Sardi, S. P., Cedarbaum, J. M., Brundin, P. Targeted Therapies for Parkinson’s Disease: From Genetics to the Clinic. Journal of Movement Disorders. 33 (5), 684-696 (2018).
- Steger, M., et al. Phosphoproteomics reveals that Parkinson’s disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife. 5, (2016).
- Ito, G., et al. Phos-tag analysis of Rab10 phosphorylation by LRRK2: a powerful assay for assessing kinase function and inhibitors. Biochemical Journal. 473 (17), 2671-2685 (2016).
- Alessi, D. R., SammLer, E. LRRK2 kinase in Parkinson’s disease. Science. 360 (6384), 36-37 (2018).
- Yue, M., et al. Progressive dopaminergic alterations and mitochondrial abnormalities in LRRK2 G2019S knock-in mice. Neurobiology of Disease. 78, 172-195 (2015).
- Doggett, E. A., Zhao, J., Mork, C. N., Hu, D., Nichols, R. J. Phosphorylation of LRRK2 serines 955 and 973 is disrupted by Parkinson’s disease mutations and LRRK2 pharmacological inhibition. Journal of Neurochemistry. 120 (1), 37-45 (2012).
- Sheng, Z., et al. Ser1292 autophosphorylation is an indicator of LRRK2 kinase activity and contributes to the cellular effects of PD mutations. Science Translational Medicine. 4 (164), (2012).
- Fan, Y., et al. Interrogating Parkinson’s disease LRRK2 kinase pathway activity by assessing Rab10 phosphorylation in human neutrophils. Biochemical Journal. 475 (1), 23-44 (2018).
- Scott, J. D., et al. Discovery of a 3-(4-Pyrimidinyl) Indazole (MLi-2), an Orally Available and Selective Leucine-Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) Inhibitor that Reduces Brain Kinase Activity. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (7), 2983-2992 (2017).
- Pham, C. T. Neutrophil serine proteases: specific regulators of inflammation. Nature Reviews Immunology. 6 (7), 541-550 (2006).
- Lis, P., et al. Development of phospho-specific Rab protein antibodies to monitor in vivo activity of the LRRK2 Parkinson’s disease kinase. Biochemical Journal. 475 (1), 1-22 (2018).
- Mir, R., et al. The Parkinson’s disease VPS35[D620N] mutation enhances LRRK2-mediated Rab protein phosphorylation in mouse and human. Biochemical Journal. 475 (11), 1861-1883 (2018).
- Rieckmann, J. C., et al. Social network architecture of human immune cells unveiled by quantitative proteomics. Nature Immunology. 18 (5), 583-593 (2017).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Bain, B., Dean, A., Broom, G. The estimation of the lymphocyte percentage by the Coulter Counter Model S Plus III. Clinical & Laboratory Haematology. 6 (3), 273-285 (1984).
- Tomazella, G. G., et al. Proteomic analysis of total cellular proteins of human neutrophils. Proteome Science. 7, 32 (2009).
