ステンレス高品質レーザーからの RNA の隔離のプロトコルをキャプチャ人間死後小脳 Microdissected プルキンエ細胞

レーザー キャプチャ レーザーマイクロダイ セクション (LCM) は、その後分子駆動評価の病理組織学的に関連する細胞の分離を可能にする貴重な研究ツールです。これら異種組織標本の病理組織学的および臨床的データとの相関分子生物学的解析の使用は、生物学的研究¹の並進運動の意義を評価する際に必要なステップです。RNA による遺伝子発現データを解析するとき凍結するティッシュ セクションの使用それは RNA の優れた品質のことができますようお勧めと同様数量²を最大化します。それが RNA シーケンス³から意味のあるデータに不可欠な高品質・ RNA 量も確立されています。ただし、最小公倍数の新鮮な冷凍事後組織からの RNA を使用している場合 RNA の劣化は大きな課題が、それが死亡時にすぐに発生してその程度は組織コレクション メソッド^{4,5 に関連するさまざまな要因によって仲介されます。}.さらに、RNA の劣化が悪化する染色技術組織の詳細や細胞の識別を認識する必要がある場合。染色技術、ヘマトキシリン ・ エオシン、ニッスル染色などで専門的な蛍光抗体法および免疫組織化学周囲の間質から細胞の鑑別に有用が RNA を低下し、転写産物発現の変更が示されています。プロファイル⁶。したがって、当研究室では、死後人間の小脳のプルキンエ細胞の LCM 分離後の RNA シーケンスのため RNA を維持するために特別に設計されたステンレス プロトコルを作成しています。

LCM の新鮮凍結するティッシュを処理固定方法は必ず RNA と組織の両方の整合性を影響することができます。ホルマリン固定は形態学的保全のための標準が、架橋する原因かもしれない RNA のフラグメントし RNA 増幅⁷を妨げます。架橋¹を誘発しない凝固定着剤として、エタノールの固定は RNA の隔離のためのより良い代替手段です。組織形態の可視化を高めるためには、キシレンは、最良の選択では、それは組織からの脂質を削除します。しかし、組織が乾燥し、レーザー キャプチャ⁷脆性の原因となる組織断片化になる、lcm、キシレンを利用する場合、制限知られています。キシレンはまた、揮発性の毒素と発煙のフードで正しく処理する必要があります。それにもかかわらず、キシレンは⁸RNA の整合性を維持しながら組織の可視化を高めるために示されています。したがって、我々 のプロトコルは 70% のエタノールの固定のエタノール脱水、キシレン潜伏形態の明快さのために続いて使用中心します。

彼らは、速度、精度、および RNA の品質が異なるに示されている異なったタイプのレーザー ベース レーザーマイクロダイ セクション システムに注意してくださいすることが重要です。赤外線 (IR) レーザーはレーザーマイクロダイ セクションと紫外線 (UV) レーザー マイクロビーム レーザーマイクロダイ セクション システムをキャプチャし、ほぼ同時に登場した⁸小説 LCM プラットフォームは両方でした。IR LCM システムは組織切片上に直接配置透明熱可塑性フィルムを使用して「コンタクト システム」を採用しています、興味のセル選択してフィルムに付着、集光によって IR レーザーから。また、UV LCM システムは「非接触システム」という集光レーザビームを切り取った細胞や組織興味の地域倒立か正立顕微鏡デザインのいずれかを使用して、2 つの現在利用可能な商用プラットフォームの構成に応じて組織が重力に逆らってカタパルト レーザー誘起圧力波による回収装置に取得または組織がそれぞれ、重力によって収集されます。UV LCM システムの重要な利点には、高速細胞捕捉、非接触アプローチと多く小さいレーザー ビーム直径⁹によるより正確な解剖汚染無料コレクションが含まれます。このプロトコルは、UV LCM システム用に設計されました、IR LCM システムでテストされていません。いずれかの UV LCM システム設計におけるコレクション キャップに蓄積細胞、観察の使用を高めるとき顕微鏡で細胞の明快さは適していません、セルはコレクション キャップに入ることになります。したがって、組織の可視化を高めるためには、我々 は液体充填コレクション キャップに対して UV LCM システムで可視の観察として設計されている不透明なコレクション キャップの使用をテストしました。液体蒸発され、顕微鏡で働いている間頻繁に交換する必要があります、液体充填コレクション キャップに挑戦することができます。時間には、キャプチャされた組織はすぐに⁷を溶解する RNA の安定性の重要な要因がようになります。

当研究室は、(ET) 本態性振戦患者の小脳・小脳の関連神経変性疾患の死後神経病理学的変化を研究します。我々 は仮定する私たちをリード ET ケースとプルキンエ細胞の数の減少などのコントロールを区別プルキンエ細胞を中心とした形態学的変化増加樹状回帰とさまざまな軸索の変化を示しているそのプルキンエ細胞の変性は、ET 病態^{10、11,12,13}コアの生物学的機能です。転写プロファイルは細胞退行性変化の基になる分子基盤を探索する多くの神経疾患で使用されています。ただし、脳組織などの異種のサンプルから転写プロファイル効果的低豊富な転写産物の発現をマスクしたり、分子の変更の影響を受ける小集団でのみ発生するの検出を減少させる小脳皮質のプルキンエ細胞などの細胞。例えば、プルキンエ細胞が大幅に劣勢小脳皮質で豊富な顆粒細胞で約 1:3000;したがって、効果的にターゲットへのトランスクリプトームこれらのニューロンの特定の分離が必要です。小脳皮質は、細胞密度とセルのサイズが異なる別個の層で区切られます。この細胞アーキテクチャは、染色試薬の色素添加せず新鮮凍結組織サンプルの可視化に最適です。このプロトコルは、理論的には、同様の特徴的な組織を持つ他の組織型にも適用できる組織。

このプロトコルは、仕事人間死後の小脳プルキンエ細胞の可視化のために特別に設計されました。固定は、赤外線と紫外線の両方 – LCM の目的のための可視化と組織の多くの種類の RNA 保全を染色のため多数のプロトコルが存在します。UV LCM の実験的デザインを考えて、個人はニーズと開始と終了の材料の要件に合わせてプロトコルを調整すべき。ここでは、我々 はトランスクリプトームの高品質 RNA を準備する染色試薬を含む色素を必要とせず死後人間の小脳プルキンエ細胞を可視化するための拡張メソッドを提供するために別の LCM のプロトコルの多くの側面を組み合わせるシーケンス。