Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento di ricerca di valore che consente la separazione delle cellule patologicamente rilevanti per la valutazione molecolare guidata successiva. L’uso delle analisi molecolari in questi campioni di tessuto eterogeneo e la correlazione con dati clinici e patologici è un passo necessario nel valutare l’importanza traslazionale della ricerca biologica¹. Quando si analizzano i dati di espressione genica da RNA, l’uso di sezioni di tessuto congelato è altamente consigliato in quanto consente di eccellente qualità di RNA così come ingrandita quantità². È stata ben stabilita che alta qualità e la quantità di RNA sono essenziali per dati significativi da RNA sequenza³. Tuttavia, quando si utilizza RNA dal tessuto fresco congelato post mortem per LCM, degradazione del RNA è una sfida importante, come si verifica immediatamente dopo la morte e la sua estensione è mediata da vari fattori connessi con il tessuto collezione metodo^4,5 . Inoltre, degradazione del RNA è aggravata quando tecniche di colorazione sono necessari per riconoscere dettagli istologici e l’identificazione delle cellule. Specializzata macchiatura tecniche come l’ematossilina ed eosina, di Nissl, immunofluorescenza e immunoistochimica sono utili nella differenziazione delle cellule dallo stroma circostante ma hanno dimostrati di degradare il mRNA e alterare l’espressione di trascrizione profili⁶. Di conseguenza, il nostro laboratorio ha creato un protocollo inox specificamente progettato per preservare il RNA in cervelletto umano post mortem ai fini del sequenziamento di RNA dopo l’isolamento di LCM di neuroni di Purkinje.

Nell’elaborazione di tessuto congelato fresco per LCM, il metodo di fissazione variabilmente può influenzare l’integrità del tessuto e del RNA. Fissazione in formalina è standard per conservazione morfologica, ma cause cross-linking che possono frammentare RNA e interferire con l’amplificazione di RNA⁷. Fissazione dell’etanolo è un’alternativa migliore per l’isolamento di RNA, come è un fissativo coagulante che non induce la reticolazione¹. Per migliorare la visualizzazione della morfologia del tessuto, xilene è la scelta migliore, in quanto rimuove i lipidi dal tessuto. Tuttavia, ci sono note alcune limitazioni quando si utilizza xilene in LCM, come i tessuti possono asciugarsi e diventare fragili che causano frammentazione del tessuto su laser capture⁷. Xilene è anche una tossina volatile e deve essere gestito correttamente in una cappa aspirante. Tuttavia, xilene è stato indicato per migliorare la visualizzazione del tessuto preservando anche RNA integrità⁸. Di conseguenza, il nostro protocollo centri intorno all’uso della fissazione dell’etanolo 70% ed etanolo disidratazione, seguita da incubazione di xilene per chiarezza morfologica.

È importante notare i diversi tipi di sistemi basati sul laser microdissection, come essi hanno dimostrati di differiscono in velocità, precisione e qualità di RNA. Il laser infrarosso (IR) capture microdissection e i sistemi di raggi ultravioletti (UV) laser microbeam microdissection erano entrambe le piattaforme LCM romanzo emerse quasi contemporaneamente⁸. Il sistema IR-LCM si avvale di un “sistema di contatto” utilizzando una pellicola termoplastica trasparente collocata direttamente sulla sezione di tessuto, e celle di interesse selettivamente aderiscano la pellicola da impulsi focalizzati da un laser a infrarossi. In alternativa, il sistema UV-LCM è un sistema”senza contatto”, per cui un raggio laser focalizzato taglia via le cellule o le regioni di interesse nel tessuto; a seconda della configurazione in due piattaforme commerciali attualmente disponibili che utilizzano entrambi un design microscopio invertito o in posizione verticale, tessuto viene acquisito in un dispositivo di raccolta da un’onda di pressione indotta da laser che si catapulta contro la gravità o il tessuto è raccolti dalla forza di gravità, rispettivamente. Vantaggi del sistema UV-LCM includono acquisizione delle cellule più veloce, privo di contaminazione insieme con l’approccio di non-contatto e più precisa dissezione dovuto un molto più piccolo laser fascio diametro⁹. Questo protocollo è stato specificamente progettato per un sistema UV-LCM e non è stato testato in un sistema di IR-LCM. Nella progettazione di sistema o UV-LCM, quando cellule accumula nella PAC raccolta, l’uso di un vetrino coprioggetto che migliora la chiarezza cellulare durante la microscopia non è adatto, come le cellule sarebbe in grado di entrare nella PAC collezione. Di conseguenza, per migliorare la visualizzazione del tessuto, abbiamo testato l’uso di tappi insieme opaco, che sono progettati per fungere da un vetrino coprioggetto per visualizzazione microscopica in sistemi UV-LCM, contro tappi di raccolta del liquido riempito. Tappi di raccolta del liquido riempito possono essere difficile, come il liquido è soggetta a evaporazione e dovrà essere sostituito frequentemente mentre si lavora al microscopio. Tempo diventa un fattore importante per la stabilità del RNA, mentre il tessuto catturato si dissolve immediatamente⁷.

Il nostro laboratorio studia i cambiamenti neuropathologic post mortem nel cervelletto dei pazienti con tremore essenziale (ET) e disordini neurodegenerative correlate del cervelletto. Abbiamo dimostrato i cambiamenti morfologici centrati sulle cellule di Purkinje che distinguono ET casi contro i comandi, tra cui un numero ridotto di cellule di Purkinje, aumentato dendritiche regressione e una varietà di cambiamenti axonal, che ci porta a postulare che Purkinje degenerazione delle cellule è una caratteristica biologica di core ET patogenesi^10,11,12,13. Profiling trascrizionale è stato utilizzato in molte malattie neurologiche per esplorare la base molecolare sottostante dei cambiamenti cellulari degeneranti. Tuttavia, profili trascrizionali da campioni eterogenei, quali regioni del tessuto di cervello, efficacemente possono mascherare l’espressione delle trascrizioni di abbondanza bassa e/o diminuire la rilevazione dei cambiamenti molecolari che si verificano solo in una piccola popolazione di interessati cellule, come le cellule di Purkinje nella corteccia cerebellare. Per esempio, cellule di Purkinje sono grave inferiorità numerica da parte delle cellule del granello abbondante nella corteccia cerebellare di circa 1: 3000; così, efficacemente destinazione loro transcriptome richiede l’isolamento specifico di questi neuroni. La corteccia cerebellare è delineata da strati distinti che differiscono nella densità delle cellule e la dimensione della cella. Questa architettura cellulare è ideale per visualizzare in un campione di tessuto fresco congelato senza tintura-contenente i reagenti di colorazione. In teoria, questo protocollo potrebbe essere applicato anche ad altri tipi di tessuto che hanno tessuto distintivo simile organizzazione.

Questo protocollo è stato progettato per lavorare in modo specifico per la visualizzazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem. Esistono numerosi protocolli per la fissazione, colorazione, visualizzazione e conservazione di RNA di molti tipi di tessuti ai fini di entrambi LCM IR e UV. Quando contemplando un disegno sperimentale per UV-LCM, gli individui dovrebbero adattare loro protocollo per adattarsi al meglio le esigenze e i requisiti di inizio e fine di materiali. Qui, uniamo molti aspetti dei diversi protocolli di LCM per fornire un metodo avanzato per la visualizzazione di cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem senza dover preparare il RNA di alta qualità per il trascrittoma di colorante contenente i reagenti di colorazione sequenziamento.