Un protocole en acier inoxydable pour l’ARN haute qualité laser capturer des cellules de Microdissected Purkinje du cervelet humain Post-Mortem

Microdissection de saisie de laser (LCM) est un précieux outil de recherche qui permet de séparer les cellules pathologiquement pertinentes pour les évaluations subséquentes moléculairement entraînée. L’utilisation des analyses moléculaires dans ces échantillons de tissus hétérogènes et la corrélation avec les données cliniques et pathologiques est une étape nécessaire pour évaluer l’importance translationnelle de la recherche biologique¹. Lors de l’analyse des données d’expression de gène de l’ARN, l’utilisation de coupes de tissus congelés est hautement recommandée car il permet l’excellente qualité de l’ARN ainsi que maximiser la quantité². Il a été bien établi que la qualité et la quantité d’ARN sont essentiels pour des données significatives de RNA séquençage³. Toutefois, lorsque vous utilisez RNA de tissus frais congelés post mortem pour LCM, dégradation de l’ARN est un défi majeur, car il se produit immédiatement après la mort et son étendue est médiée par des facteurs divers associés avec les tissus collection méthode^4,5 . En outre, dégradation de l’ARN est exacerbée lorsque des techniques de coloration sont nécessaires pour reconnaître les détails histologiques et l’identification de la cellule. Spécialisée de coloration des techniques telles que l’hématoxyline et éosine, teinté de Nissl, immunofluorescence et l’immunohistochimie sont utiles pour différencier les cellules du stroma environnant, mais auraient dû être divulgués à dégrader RNA et modifier l’expression de la transcription ⁶de profils. Par conséquent, notre laboratoire a créé un protocole en acier inoxydable spécialement conçu pour préserver les RNA dans post mortem cervelet humain aux fins de séquençage de RNA après isolement de LCM des neurones de Purkinje.

Dans le traitement des tissus congelés frais pour LCM, la méthode de fixation peut affecter variablement d’intégrité d’ARN et de tissus. Fixation de formol est standard pour la préservation morphologique, mais causes réticulation qui peuvent fragmenter RNA et nuire à la RNA amplification⁷. Fixation de l’éthanol est une meilleure alternative pour les ARN, comme c’est un fixateur coagulantes qui n’induit pas de réticulation¹. Afin d’améliorer la visualisation de la morphologie tissulaire, xylène est le meilleur choix, car il supprime des lipides dans les tissus. Cependant, il existe connus des limitations lors de l’utilisation de xylène dans LCM, car les tissus peuvent sécher et devenir cassant causant fragmentation de tissu sur laser capture⁷. Xylène est aussi une toxine volatile et doit être manipulé correctement sous une hotte. Néanmoins, le xylène a été démontré pour améliorer la visualisation des tissus tout en préservant l’intégrité de RNA⁸. Par conséquent, notre protocole est centrée autour de l’utilisation de la fixation de l’éthanol 70 % et de déshydratation de l’éthanol, suivie d’incubation xylène pour plus de clarté morphologiques.

Il est important de noter les différents types de systèmes de microdissection laser-basé, comme ils auraient dû être divulgués diffèrent en vitesse, précision et qualité de RNA. Laser infrarouge (IR) capture microdissection et les systèmes microdissection des microfaisceaux de laser ultraviolets (UV) étaient les deux plates-formes de LCM nouveaux qui ont émergé, presque en même temps,⁸. Le système IR-LCM emploie un « système de contact » à l’aide d’un film thermoplastique transparent placé directement sur la section de tissus et cellules d’intérêt sélectivement adhèrent au film par impulsions ciblées d’un laser IR. Alternativement, le système UV-LCM est un « système de non-contact » par laquelle un faisceau laser focalisé coupe loin des cellules ou des régions d’intérêt dans le tissu ; Selon la configuration à deux plates-formes commerciales actuellement disponibles qui utilisent soit un design microscope inversé ou redressée, tissu est acquis dans un dispositif de collecte par une onde de pression induite par laser qu’il propulse contre la gravité ou le tissu est recueillis par gravité, respectivement. Des avantages significatifs du système UV-LCM incluent accélérer l’acquisition cellulaire, collection sans contamination avec l’approche sans contact et une dissection plus précise grâce à un beaucoup plus petit laser faisceau de diamètre⁹. Ce protocole a été spécialement conçu pour un système UV-LCM et n’a pas été testé dans un système IR-LCM. Soit design du système UV-LCM, lorsque les cellules s’accumulent dans le capuchon de la collection, l’utilisation d’une lamelle qui améliore la clarté cellulaire au cours de la microscopie ne convient pas, car les cellules seraient incapables d’entrer dans le plafond de la collection. Par conséquent, pour améliorer la visualisation des tissus, nous avons testé l’utilisation de bouchons collection Opaque, qui sont conçus pour agir comme un lamelle couvre-objet pour visualisation microscopique dans les systèmes UV-LCM, contre casquettes collection remplie liquide. Casquettes de la collection remplie liquide peuvent être difficile, car le liquide est soumise à l’évaporation et doit être remplacé fréquemment alors qu’il travaillait au microscope. Le temps devient un facteur important pour la stabilité du RNA, comme le tissu capturé dissout immédiatement⁷.

Notre laboratoire étudie les changements neuropathologique post-mortem dans le cervelet des patients atteints de tremblement essentiel (he) et neurodégénératives apparentées du cervelet. Nous avons démontré de modifications morphologiques centrées sur des cellules de Purkinje qui distinguent ET cas par rapport aux contrôles, y compris un réduction du nombre de cellules de Purkinje, a augmenté de régression dendritique et une variété de changements axonales, qui nous conduit à postuler que Purkinje dégénérescence des cellules est une fonctionnalité de base biologique ET pathogenèse^10,11,12,13. Transcription de profilage a été utilisé dans de nombreuses maladies neurologiques pour explorer les bases moléculaires sous-jacents des changements cellulaires dégénératifs. Cependant, profils transcriptionnelles des échantillons hétérogènes, tels que des régions de tissus du cerveau, peuvent effectivement masquer l’expression de transcriptions de faible abondance et/ou diminuer la détection des changements moléculaires qui se produisent uniquement dans une petite population de touchés cellules, telles que les cellules de Purkinje du cortex cérébelleux. Par exemple, des cellules de Purkinje sont largement dépassés en nombre par les cellules de granules abondante dans le cortex cérébelleux par environ 1 : 3000 ; ainsi, pour cibler efficacement leur transcriptome exige l’isolation spécifique de ces neurones. Le cortex cérébelleux est délimité par des couches distinctes qui diffèrent dans la densité cellulaire et la taille des cellules. Cette architecture cellulaire est idéale pour visualiser dans un échantillon de tissus frais congelés sans réactifs de coloration contenant du colorant. En théorie, ce protocole pourrait également être appliqué à d’autres types de tissus qui ont même tissu distinctif organisation.

Ce protocole a été conçu pour fonctionner spécifiquement pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post-mortem. Plusieurs protocoles existent pour la fixation, la coloration de la visualisation et la préservation de RNA de nombreux types de tissus aux fins des deux IR et UV-LCM. Lorsque l’on envisage un plan expérimental pour UV-LCM, individus devraient adapter leur protocole au mieux les besoins et exigences de début et de fin des matériaux. Ici, nous combinons plusieurs aspects de différents protocoles de LCM pour fournir une méthode améliorée pour la visualisation des cellules de Purkinje dans le cervelet humain post mortem sans avoir besoin de colorant contenant des réactifs de coloration pour préparer l’ARN de haute qualité pour transcriptome séquençage.