タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

比較的単純なタンパク質の折り畳み多くの折り畳み式の異なる酵素、分子シャペロンと共有結合の変更¹が含まれます。膨大な数に関与するさまざまなコンポーネントでは、このこれらのプロセスの in vitroの完全な再構築は実質的に不可能です。したがって、生細胞の生体内でフォールディングの研究に非常に望ましいです。放射性パルス追跡技術は、合成、折りたたみ、トランスポート、および彼らの自然環境におけるタンパク質の分解を勉強するための強力なツールを証明します。

新陳代謝³⁵S] メチオニン ・ システインと短パルス中に蛋白質の分類、放射性ラベルのない状態でチェイスに続いて、新生タンパク質の細胞より広い環境の人口の特定の追跡ができます。ターゲット蛋白質分離を介して免疫沈降をすることができ、経由でSDS のページまたはその他の手法を分析します。多くのタンパク質の SDS ページのゲルの表示変更がセルを介して彼らの旅はマークされます。たとえば、ゴルジ体小胞体 (ER) から糖タンパク質の輸送はしばしば N リンク糖鎖の変更または o-結合糖鎖^2,3の追加を伴います。これらの変更は、SDS ページの移動変化によって見ることができる明白な分子量の大きい増加を引き起こします。信号ペプチド胸の谷間などの pro-ペプチドの SDS ページのゲルの⁴に簡単に続くことができる分子の質量変化により除去の蛋白質分解開裂によって成熟を付けることもできます。放射能はシクロヘキシミド追うなど同等の技術でかなりのメリット新規タンパク質合成ができない長い治療細胞に有毒であるから古い、定常状態のタンパク質の大部分を排除しないと、分析、いくつかのタンパク質の半減期日があります。パンピングの両方の下で蛋白質の比較、ジスルフィド結合形成、多く分泌蛋白質^4,5,6,の折り畳み過程における重要なステップの解析条件を減らすことができます⁷。

ここで放射性パルス追跡方法を使用してタンパク質の折り畳みとそのまま細胞内輸送の分析の一般的な方法を説明します。としてメソッドを提供している間で、プロトコル、可能な限り詳細な適応能力のほぼ無限の可能性を持って、各リーダーの特定蛋白質を研究する最適化できるようになります。

2 つの代替パルス追跡プロトコル、付着性のセル (ここで提示されたプロトコルの手順 1.1) のいずれかと懸濁細胞 (ここで提示されたプロトコルの手順 1.2) の 1 つを提供しています。ここでは、媒体式レベルで表現される蛋白質を可視化するための十分な条件が記載されて。リーダーが使用して不十分に表現された蛋白質または複数の immunoprecipitations などの閉口条件場合皿のサイズを増やすか、携帯番号を適切に必要です。

懸濁液パルス追跡の各時点で追跡サンプルがセルの単管から取得されます。洗浄の手順後、パルスは省略されます。代わりに、さらに³⁵S の設立は、ラベル付けされていないメチオニンとシステインの高い過剰希釈によって防がれます。

示されたプロトコルは細胞の蛋白質折りたたみのプロセスに従うこと放射性³⁵S ラベル システインとメチオニンを使用します。放射性試薬の操作は、オペレーターと放射性放射環境の任意の露出を最小限にし、指定のラボで実行する適切な保護措置を使用して実行する必要があります。パルス追跡として標識法は比較的非効率的短パルス時 (< 15 分)、新生タンパク質に組み込まれている開始放射能量の 1% 未満。免疫沈降を介してターゲットのタンパク質の濃縮、SDS ページのサンプルには放射能の開始量の 0.05% 未満が含まれています。

³⁵S メチオニンとシステインの分類の組合せが安定、揮発性の放射性化合物をもたらすいくつかの分解が発生します。研究者と装置を保護するためにいくつかの注意が取られなければ必要があります。研究者は局所放射線安全規則に従う必要があります常に、マスク、白衣、手袋 (ダブル) ほかを看護炭を着ることがあります。³⁵S メチオニンとシステインのストックのバイアルは、発煙のフードまたはローカル吸引ポイントの下で常に開いてください。知られている実験室汚染スポットは、シェーカー、インキュベーター、水浴ピペット遠心分離機です。活性炭フィルター、肯定的なシール マイクロ遠心チューブ用 (材料の表を参照してください)、水風呂、炭濾紙パルス追跡皿に接着で水族館炭スポンジ ピペット チップを使用して、これらの地域の汚染が減少します。吸引システムとインキュベーターや貯蔵容器に炭の粒を含んでいる皿の配置で炭のガード。