Summary

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Published: May 01, 2019
doi:

Summary

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l’uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Abstract

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono uno dei prodotti biologici più popolari e ben caratterizzati prodotti oggi. Più comunemente prodotto utilizzando cellule dell’ovaio di criceto cinese (CHO), coltura e condizioni di processo devono essere ottimizzati per massimizzare i titer anticorpe e raggiungere profili di qualità target. In genere, questa ottimizzazione utilizza bioreattori automatizzati su microscala (15 mL) per lo screening di più condizioni di processo in parallelo. I criteri di ottimizzazione includono le prestazioni di coltura e gli attributi di qualità critici (CQA) del prodotto anticorpo monoclonale (mAb), che possono influenzare la sua efficacia e sicurezza. Le metriche delle prestazioni legate alla cultura includono la crescita delle cellule e il consumo di nutrienti, mentre i CQA includono i profili di N-glicosilazione e aggregazione del mAb, le varianti di carica e il peso molecolare. Questo protocollo dettagliato descrive come purificare e successivamente analizzare i campioni HCCF prodotti da un sistema microbioriale automatizzato per ottenere preziose metriche e output delle prestazioni. In primo luogo, una proteina automatizzata Un metodo di cromatografia liquida a proteina veloce (FPLC) viene utilizzato per purificare il mAb da campioni di coltura cellulare raccolti. Una volta concentrati, i profili glicani vengono analizzati dalla spettrometria di massa utilizzando una piattaforma specifica (fare riferimento alla Tabella dei Materiali). I pesi molecolari dell’anticorpo e i profili di aggregazione sono determinati utilizzando la cromatografia ad esclusione di dimensioni- la dispersione della luce ad angolo multiplo (SEC-MALS), mentre le varianti di carica vengono analizzate utilizzando l’elettroforesi della zona capillare del microchip . Oltre alle metriche delle prestazioni culturali acquisite durante il processo di bioreattore (cioè la vitalità della coltura, il numero di cellule e i metaboliti comuni, tra cui glutammina, glucosio, lattato e ammoniaca), vengono analizzati i supporti spesi per identificare i nutrienti migliorare le strategie di alimentazione e la progettazione complessiva del processo. Pertanto, viene descritto anche un protocollo dettagliato per la quantificazione assoluta degli amminoacidi mediante spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS) dei supporti esauriti. I metodi utilizzati in questo protocollo sfruttano le piattaforme ad alta velocità effettiva compatibili per un numero elevato di campioni di piccoli volumi.

Introduction

Le terapie proteiche vengono utilizzate per trattare una crescente varietà di condizioni mediche, tra cui complicazioni del trapianto di tessuto, disturbi autoimmuni e tumori1. Dal 2004, la Food and Drug Administration (USFDA) degli Stati Uniti ha documentato una percentuale crescente di domande di licenza biologica (BLA) di tutte le approvazioni regolate dal Center for Drug Evaluation and Research (CDER), con BLA che rappresentano oltre il 25% nel 2014 e nel 20152.

Considerando questo mercato in espansione, i produttori di biofarmaceutici sono sfidati con la fornitura rapida di più prodotti con qualità costante. Gli sforzi per aumentare la resa dei prodotti si sono concentrati sull’ingegneria delle celle CHO e sullo screening della linea di produzione, anche se i miglioramenti più significativi sono dovuti ai progressi nell’ottimizzazione della strategia media/feed e nei controlli ambientali della coltura cellulare1, 3 (COM del nome , 4 DEL psu’ , 5 durante il processo di produzione.

Poiché i mAb sono prodotti in un sistema biologico, ci può essere una variabilità intrinseca delle proteine. La composizione degli anticorpi può essere alterata post-traduzione, come la glicosilazione o influenzata da degradazione o reazioni enzimatiche. Queste variazioni strutturali possono provocare reazioni immunitarie pericolose o alterare il legame degli anticorpi, che a sua volta può ridurre o eliminare la funzione terapeutica prevista5. Pertanto, gli attributi di qualità critica (CQA) degli anticorpi monoclonali – profilo N-glican, distribuzione della variante di carica e percentuale di anticorpi in forma monomerica – sono regolarmente monitorati e controllati come parte di un approccio Quality by Design (QbD) durante processi di produzione1,6. In un ambiente di produzione regolamentato, le proteine terapeutiche devono soddisfare i criteri di accettazione per essere autorizzate come prodotto farmacologico commerciale approvato7. I metodi qui presentati sono in genere parte del processo di caratterizzazione di qualità per un anticorpo7,8, e qualsiasi scienziato proteico avrà familiarità con il loro utilizzo.

Nel lavoro precedente9, è stata descritta l’applicazione e il funzionamento di microbioricheper lo screening ad alta produttività delle condizioni di coltura cellulare nel bioprocesso a monte. Il prodotto purificato ottenuto dalle diverse condizioni dei supporti è sottoposto ad analisi N-glycan utilizzando modelli LC-MS. Glycosylation di proteine terapeutiche può essere rilevato e caratterizzato utilizzando tecniche LC-MS10,11, e la presenza di varie specie di glicani è stata collegata a parametri di bioprocesso quali strategia di alimentazione, pH e temperatura12. L’effetto delle diverse condizioni dei media sulla qualità del prodotto, indicato dalla percentuale dell’IgG risultante in forma monomerica, viene valutato anche con La cromatografia di esclusione delle dimensioni- Dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)13,14 , 15.Il profilo della variante di carica rappresenta una serie di modifiche16 che potrebbero influire sulla funzione di un prodotto. L’elettroforesi a zona microcapillare (mC) è una tecnica che offre un tempo di analisi notevolmente più veloce rispetto alla cromatografia tradizionale dello scambio di cation (CEX) e ai metodi di messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) utilizzati per l’analisi delle varianti di carica17 ,18. Sono stati analizzati i supporti di bioreattori spesi per monitorare il consumo di amminoacidi durante la produzione di proteine in relazione ai cambiamenti negli attributi identificativi dell’anticorpo19,20,21,22 , 23.

L’analisi delle proteine ci consente di identificare i parametri di processo critici (CPP) in base alle relazioni tra gli input di processo e i cambiamenti nei CQA. Durante lo sviluppo del bioprocesso, l’identificazione e la misurazione dei CPC dimostra fondamentalmente il controllo dei processi e assicura che il prodotto non sia cambiato, il che è essenziale in ambienti di produzione altamente regolamentati. In questo documento vengono presentate tecniche analitiche per misurare alcune delle caratteristiche biochimiche delle proteine più pertinenti al prodotto CQA (profilo N-glican, varianti di carica e omogeneità delle dimensioni).

Protocol

1. Purificazione degli anticorpi NOTA: Il buffer di equilibratione per l’anticorpo interno è 25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5. Il buffer di eluizione utilizzato è di 0,1 M di acido acetico. I tamponi e la resina (Proteina A) dipendono dall’anticorpo specifico purificato. Il volume della colonna è equivalente all’altezza del letto della resina. La quantità di fase mobile utilizzata è determinata in termini di volume di colonna. Inizializzazione del sistema di depurazione Aprire il software collegato al sistema di purificazione. Utilizzando le istruzioni manuali, eclacazione della colonna con il buffer di equilibratione ad una portata di 2 mL/min per 40 min. Interrompere la corsa manuale dopo l’equilibratione. Nel collettore frazionario, posizionare 15 mL di tubi conici per raccogliere l’eluate di anticorpi purificati e tubi conici da 50 mL per raccogliere il flusso attraverso durante la lavaggio ad alto contenuto di sale. Assicurarsi che il raccoglitore frazioni venga reimpostato sulla posizione iniziale aprendo e chiudendo il raccoglitore frazioni prima dell’inizio della conclora. Il collettore di frazioni è mantenuto a 7 gradi centigradi.NOTA: il collettore frazioni può essere reimpostato manualmente nella scheda Raccolta frazioni in Impostazioni, sia per i tubi da 15 mL che per i tubi da 50 mL. Iniezione di campioniNOTA: Il fluido di coltura cellulare raccolto utilizzato nelle seguenti procedure è stato ottenuto dalle cellule dell’ovaio di criceto cinese coltivate in microreattori automatizzati9. Aggiungete il liquido di coltura delle cellule di raccolta filtrato da 0,22 m a una siringa vuota da 12 mL la cui estremità dell’ugello è tagliata. Tenendo la siringa con l’ugello rivolto verso il basso, inserire lo stantuffo della siringa fino a quando una piccola parte dello stantuffo è in. Assicurarsi che il fluido non perda, girare la siringa con l’ugello rivolto verso l’alto e rimuovere il tappo. Tenendo ancora la siringa con l’ugello rivolto verso l’alto, spingere il cilindro per dissipare l’aria fino a quando il fluido di coltura cellulare è sulla punta dell’ugello. Inserire l’ugello della siringa nella porta di iniezione manuale sul sistema di purificazione e torcere per stringere. Spingere verso il basso sullo stantuffo fino a quando tutto il campione viene iniettato ed è visibile nel ciclo di campioni di grandi volumi di grandi dimensioni collegato da 10 mL. Aprire il file del metodo salvato. Salvare il file dei risultati nella posizione desiderata e specificare il nome del file quando richiesto. Eseguire dopo che il campione è stato iniettato nel ciclo del campione di grandi volumi. Esecuzione del metodo di purificazione Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento (passaggio 1.2.5).NOTA: il sistema è impostato per eseguire la procedura seguente. L’utente non deve fare nulla mentre lo strumento è in esecuzione. Equilibrate la colonna con tre volumi di colonne (CV) di contattuazione equilibratione ad una portata di 2 mL/min. Una volta che la colonna è equilibrata, il sistema, utilizzando il ciclo del campione di grande volume, inietterà il campione sulla colonna ad una portata di 1 mL/min. Un calo del segnale UV a 280 nm indica che il caricamento del campione è terminato. Lavare la colonna con buffer di equilibratione ad una portata di 2 mL/min fino a quando il segnale UV scende al di sotto di 25 mAU. Utilizzare quattro CV da 25 mM Con 1 M NaCl a pH 7.5 per eseguire una lavaggio secondario ad alto sale ad una velocità di flusso di 2 mL/min. Il collettore di frazioni di sistema raccoglierà qualsiasi proteina/DNA che esce dalla colonna durante il lavaggio del sale in tubi da 50 mL. Applicare cinque CV di buffer di eluizione a una portata di 1 mL/min per eluire l’anticorpo dalla colonna. Raccogliere l’eluato in tubi da 15 mL in base al segnale UV; quando il segnale UV 280 è superiore a 35 mAU, inizia la raccolta; la raccolta termina quando il segnale scende al di sotto di 50 mAU; questo è chiamato taglio di picco.NOTA: il taglio di picco garantisce la normalizzazione dei profili di eluizione ed evitare il tailing di picco di eluizione che può contenere aggregati proteici24. Lavare la colonna utilizzando tre CV di cuscinetto per l’equilibratione. La corsa termina dopo la fase di lavaggio. Dopo l’eluizione neutralizza immediatamente la proteina purificata usando una base di 1 M Tris fino a un pH di 5,5 dollari. Misurare la concentrazione proteica utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis a 280 nm e 260 nm e conservarlo a 4 gradi centigradi. Concentrare l’anticorpo purificato utilizzando unità centrifughe (passaggio 2). Quindi sottoporre l’anticorpo purificato all’analisi del glicano utilizzando LC-MS e dopo l’analisi del profilo di aggregazione utilizzando SEC-MALS (passaggi 3 e 4).NOTA: L’anticorpo purificato non deve essere congelato senza ulteriori scambi di buffer in quanto i frequenti cicli di congelamento-scongelamento possono causare aggregazione e precipitazioni. 2. Concentrazione di anticorpi purificati NOTA: Il buffer Tris-acetato è di 0,1 M di acido acetico neutralizzato con 1 M Tris Base a un pH di 5,5 dollari. Inserire 100 filtri kDa nei tubi di centrifuga. Lavare i filtri con 500 l di acqua a doppia distillazione. Centrifuga per 10 min a 14.000 x g a temperatura ambiente (RT). Ripetere questo passaggio due volte. Scartare il filtrato. Trasferire i filtri risciacquati in tubi di centrifuga freschi e aggiungere 500 l di campione ad ogni filtro. Centrifuga per 10 min a 14.000 x g. Invertire il filtro in un tubo di rotazione fresco. Centrifuga per 2 min a 1.000 x g per raccogliere il campione concentrato. Determinare le concentrazioni del campione utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Svuotare lo spettrofotometro utilizzando una soluzione di buffer Tris-acetato. Utilizzare un coefficiente di estinzione delle proteine di 1,37 mL .(mg-cm)-1 a 280 nm per una soluzione IgG dell’1% (% m/v). Utilizzare il campione concentrato per preparare una soluzione di lavoro di 2 mg/mL per l’analisi del glicano e 30 di 3,5 mg/mL per sec-MALS.NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. I campioni devono essere refrigerati a 4 gradi centigradi. A 2 concentrazione di mg/mL, questi campioni dovrebbero essere stabili per almeno tre mesi a 4 gradi centigradi, mentre concentrazioni più elevate potrebbero precipitare. 3. Analisi di N-glicani mediante spettroscopia di massa Etichettatura e isolamento N-Glycan Iniziare con concentrazioni di anticorpi di 2 mg/mL in un buffer appropriato come fosfato di sodio neutro, citrato o tampone HEPES. Preparare uno standard mAb intatto (come NIST mAb) a 2 mg/mL per elaborare insieme ai campioni sperimentali per servire come controllo positivo.NOTA: gli anticorpi devono trovarsi in un buffer finale che non contiene SDS e nucleofili inferiori a 0,1 mM (come Tris, DTT, glicina o istidina). SDS nel buffer di esempio deve essere rimosso. Se i nucleofili sono nel buffer, diluirli verso il basso o eseguire uno scambio di buffer in quanto interferiranno con il kit. Il protocollo generale è fornito con il kit glicano. Diluire 7,5 l degli anticorpi con 15,3 litri di acqua LC-MS-grade in tubi da 1 mL forniti con il kit e poi denaturare utilizzando una soluzione di 6 % di un surfactant enzimatico e MS-friendly a 90 gradi centigradi per 3 min. Raffreddare i campioni per 3 min a temperatura ambiente (RT). Quindi, aggiungere 1,2 l l di PNGase F e incubare per 5 min a 50 gradi centigradi. Dopo il raffreddamento da 3 min a RT, etichettare gli N-glicani slittati aggiungendo 12 -L di reagente fluorescente disciolto in anidridedidimetilformamide (DMF) e attendere 5 min. Diluire la miscela N-glicana etichettata con 358 l di acetonitle (ACN). Collocare una piastra cromatografica di interazione idrofila (HILIC) in un collettore a vuoto con shim e vassoio di scarto. Utilizzare una pipetta multicanale per un numero elevato di campioni. Condizionare i pozzi con 200 gradi di acqua, dove il vuoto è regolato in modo che il liquido ci vorrà 15-30 s per passare attraverso la resina HILIC. Prima di caricare la miscela di glicani etichettata aCcon etichettata ACN (400 l), applicando il vuoto dopo l’aggiunta di ogni nuovo liquido ai pozzi. Lavare la resina con 600 : L dell’1% di acido formica (FA)/90% ACN due volte. Sostituire il vassoio dei rifiuti con tubi da raccolta da 600. Elutare i N-glicani etichettati con tampone di eluizione SPE (3 eluzioni di 30 l ciascuna) nei tubi di raccolta. Diluire le eluzioni raggruppate con 310 – L di Diluente campione DMF/ACN. Pipette i campioni in fiale auto campionatore per essere pronti per l’analisi di fluorescenza (FLR)-MS.NOTA: Questi campioni sono stabili se conservati a -80 gradi centigradi per almeno 1 mese. Conservare la lastra HILIC nella sua confezione originale, fissata e all’interno di un desiccatore per un uso futuro. Analisi LC-MS di n-glicani etichettati Analizzare i campioni di eluizione N-glicani etichettati su un sistema di cromatografia liquida ultraperformance (UPLC) accoppiato a un rilevatore di fluorescenza e spettrometro di massa del tempo di volo quadruplicato (Q-ToF). Utilizzare una colonna omologata per la separazione cromatica dei glicani etichettati e riscaldare a 60 gradi centigradi durante le separazioni.NOTA: La colonna deve essere svuotata con il 60% acetonitrile e 40% H2O prima dell’uso: 50 CV prima del primo utilizzo o 20 CV se la colonna è stata utilizzata prima. Utilizzare il formato amilo da 50 mM (AmF) (realizzato con concentrato di fase mobile) e l’ACN 100% LC-MS-grade per le fasi mobili. L’AmF è sensibile ai cambiamenti di pH ed è utilizzabile per 1 mese dopo la miscelazione. Impostare la portata iniziale su 0,4 mL/min, con il gradiente LC che fornisce AmF crescente durante la fase di elusione. Impostare il rivelatore FLR per misurare a EX 265/EM 425 nm con una frequenza di campionamento di 2 Hz. Impostare Q-ToF sulla modalità di sensibilità iogena positiva MS1, con un intervallo di massa di 100-2.000 dalton (Da), un tempo di analisi di 0,25 secondi e un’acquisizione di dati di continuum. Utilizzare la leucina enkephalin (2 ng/L nel 50% ACN/0,1% FA) per il riferimento di massa interno, nella modalità “Non applicare la correzione”.NOTA: la correzione del riferimento di massa interno verrà applicata in un secondo momento durante l’elaborazione dei dati. Sospendere di nuovo la scala del dextran in sequenza in 22,5 gradi di H2O, 25 l di DMF e 52,5 l di ACN. Preparare 10 aliquote per lo stoccaggio a -80 gradi centigradi, in quanto la scala non è stabile per più di 24 h a temperature più elevate (temperatura ambiente, 4 gradi centigradi). La scala dextran si degrada dopo più di un ciclo di congelamento-disgelo. Collocare i campioni nel campionatore automatico impostato su 10 . Caricare una fiala della scala dextran insieme ai campioni, poiché le informazioni sul tempo di conservazione della scala verranno utilizzate per le assegnazioni mentre le informazioni di massa utilizzate per convalidare le identificazioni. Utilizzare 10 iniezioni l per i campioni e iniezioni di 7,5 ll per la scala. Iniettare campioni in triplice copia. Eseguire il metodo caricato. Identificazione N-Glycan per i dati LC-MS Eseguire l’elaborazione dei dati con un programma ottimizzato per dati di cromatometria di interazione idrofila (isromatoria di fluorescenza di massa” (HILIC-FLR-MS). Applicare correzioni di riferimento di massa interne all’interno del programma. Designare le iniezioni di scala dextran come “Standard” nelle informazioni di esempio. Nel metododi analisi , impostare i tempi di ritenzione composti di separazione su quelli dei composti ladder rilevati durante l’esecuzione. Per assicurarsi che la % dell’area venga restituita per i glicani identificati, modificare il Metodo di analisi: nella scheda Elaborazione, fare clic su Impostazioni di quantificazione – Calibrare e impostare “Tipo di adattamento della curva di calibrazione” su “Risposta relativa (%)”. 4. Analisi dell’aggregazione di anticorpi mediante SEC-MALS Preparazione del campione Trasferire la proteina diluita da 3,5 mg/mL (passaggio 2) su una fiala con un inserto in vetro da 150 . Utilizzare una punta di caricamento gel per pipet nella campana inferiore dell’inserto per evitare l’introduzione di bolle. Capovolga la fiala con un cappuccio setta e analizza subito. Conservare a 4 gradi centigradi se si analizzano in un secondo momento. Configurazione ed equilibratore SEC-MALSNOTA: analizzare l’aggregazione su SEC-MALS configurato con una cromatografia liquida ad altissima pressione (UHPLC) con un rilevatore di indice MALS e un rilevatore di indici refrattivi controllati dal software MALS. Configurare un file di metodo nel software UHPLC per il controllo del sistema UHPLC, impostando la portata a 0,4 mL/min con una fase mobile di 1x Fosfato Buffered Saline (PBS) (diluito da 10x), il volume di iniezione a 5 e il rilevatore di array Diode (DAD) per monitorare 280 nm. Impostare il tempo di esecuzione su 20 min. L’interfaccia tra i rilevatori UHPLC e Multi Angle Light Scattering – Refractive Index (MALS-RI) richiede l’uso dell’uscita analogica sul DAD. Impostare l’attenuazione DAD su 1.000 mAU nel file del metodo DAD e l’impostazione AU/UV su 1 (strumentoUV>Channels>Channel 1). Accendere la lampada DAD 30 min prima di iniziare l’analisi e impostare la lunghezza d’onda su 280 nm. Allo stesso tempo, eliminare la cella di riferimento Refractive Index (RI) per 15 min o fino a quando la linea di base è stabile e quindi chiudere la cella di riferimento. Configurare la sequenza software SEC-MALS, impostando il tempo di raccolta a 12 min, il volume di iniezione a 5, il dn/dc a 0,185 mL/g, il coefficiente di estinzione A280 se precedentemente determinato sperimentalmente o a 1,37 mL campione. Fare clic su Esegui e attendere che venga visualizzata la finestra di dialogo “in attesa di inserimento”.NOTA: Il coefficiente di estinzione A280 è specifico per la proteina di interesse e deve essere determinato sperimentalmente. Configurare un elenco di esempio nel software UHPLC nello stesso ordine del software MALS-RI e inviarlo.NOTA: è importante eseguire un controllo di idoneità del sistema prima e dopo una corsa. L’albumina del siero bovino viene in genere utilizzata per verificare l’ampliamento dei picchi, segno che la colonna SEC potrebbe aver bisogno di pulizia o sostituzione. La stessa iniezione standard BSA può essere utilizzata per specificare l’allineamento del segnale, l’ampliamento del picco e la normalizzazione del rilevatore. Analisi aggregata con il software MALS Fare clic sulla scheda Procedure. Specificare il livello minimo di sblocco richiesto; di solito nessuno è sufficiente. Verificare che le linee di base siano state disegnate correttamente e regolate se necessario, per i canali LS1, LS2, LS3, RI e UV. Impostare l’area di picco di interesse. Rivedere la distribuzione di massa molecolare per confermare che i picchi chiamati contengono particelle di dimensioni simili. 5. Analisi delle varianti di carica Preparazione ed etichettatura dei campioni Iniziare con 80 – L di una soluzione anticorpale 3,5 mg/mL. Desalare il campione utilizzando una colonna di dissalamento di 0,5 mL (7k MWCO). Preparare la colonna prima scattando il tappo inferiore, poi allentando il tappo superiore e posizionandolo in un tubo di microcentrismo da 1,7 mL. Centrifugare la colonna di salsalina per 1 min a 1.500 x g.NOTA: Contrassegnare l’esterno della colonna con un punto in modo che possa essere posizionato nell’orientamento originale per i passaggi successivi. Trasferire la colonna in un nuovo tubo di microcentrismo. Aggiungere l’80 l di proteine diluite nella parte superiore della colonna. Allineare la colonna all’orientamento originale. Centrifuga per 2 min a 1.500 x g. Togliere il campione dalla centrifuga, scartare la colonna di dealanding e mescolare bene il campione.NOTA: Il dealfiore è necessario solo se la matrice del campione contiene ammine primarie, eccipienti che perturberanno l’elettroforesi del campione o altre sostanze incompatibili. Diluire il campione fino a una concentrazione finale di 2 mg/mL in un volume di 25 ,l e aggiungere 5 l del tampone di etichettatura (vedere Tabella dei materiali: Kit ReagenteVariante Carica ) nella piastra del pozzo 96. Preparare il reagente di etichettatura diluindo la quantità necessaria di reagente di etichettatura (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit) 1:30 in dimetilformamide. Incubare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente lontano dalla luce.NOTA: È importante scongelare e quindi utilizzare immediatamente questo reagente e utilizzarlo entro 10 min di miscelazione con DMF. Dopo l’incubazione, aggiungere 60 -L di acqua di grado reagente e mescolare bene pipettando. Coprire la piastra con un sigillo a piastra e centrifugare la piastra a 1.000 x g per 1 min. Preparazione del chip della variante di carica Preparare il chip Charge Variant rimuovendo la soluzione di stoccaggio e lavando i pozzi 1, 3, 4, 7, 8 e 10 con acqua. Quindi sostituire l’acqua con il buffer di corsa pH 7.2 (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit). Aggiungete 750 l di pH 7.2 nel tubo tampone e posizionate il tubo tampone nell’angolo superiore sinistro del vassoio campione. Ora rimuovere la guargono della piastra dalla piastra del pozzo 96, premere Scarica piastra sull’interfaccia utente dello strumento e inserire la piastra nel vassoio del campione GXII.NOTA: per questa analisi sono stati utilizzati buffer pH 7.2. a seconda della proteina pI possono essere utilizzati tamponi 5,6-7,2. Quando si utilizzano buffer pH inferiori, potrebbero essere necessari tempi di esecuzione dei campioni più lunghi. Premere il pulsante Scarica chip nell’interfaccia utente. Assicurarsi che gli elettrodi siano privi di particelle e, in caso contrario, pulire con un tampone privo di lani. Quando si inserisce il chip assicurarsi che la finestra al centro del chip sia priva di particelle o macchie. Se necessario, pulire con un panno morbido senza laminetta.NOTA: Quando si lavora con chip di elettroforesi capillare, rimuovere il tampone dall’aspirazione del vuoto, seguito dall’aggiunta immediata della soluzione successiva per evitare che i pozzi si asciughino. Per ridurre al minimo l’introduzione di bolle, praticare la tecnica di reverse pipetting. Quando si maneggia il chip, tenere presente il fragile capillare che si estende dal fondo del chip, assicurandosi che non si asciughi e non scompaia attraverso la manipolazione ruvida. Chiudere il coperchio alla camera del chip e selezionare il saggio HT Protein Charge Variant. Fare clic sul pulsante Esegui. Seguire le istruzioni visualizzate per selezionare i pozzi di esempio, il tipo di piastra, l’ora di prova (68, 90 o 100 s) e il nome del file. Fare clic su Inizia alla fine delle richieste. La pulizia dei trucioli richiede il lavaggio di ogni pozzo 2x con acqua, seguita dall’aggiunta di Storage Buffer (vedere Tabella dei materiali: Charge Variant Reagent Kit). Una volta nel buffer di stoccaggio, sostituire il chip nello strumento e, quando richiesto, selezionare il saggio HT Protein Charge. Nella schermata principale selezionare Lavaggio nell’interfaccia utente. Una volta completato, rimuovere il chip, pulire gli elettrodi con acqua e un tampone senza lafo, e conservare il chip a 4 gradi centigradi. Analisi delle varianti di addebito Aprire il software di analisi dello strumento. Importare l’esecuzione scegliendo File>Importa file didati… e facendo clic sul file .gxd desiderato. Solo il nome verrà riportato al software, quindi la ridenominazione dei pozzi è vantaggiosa (Strumenti > Editor nomi di esempio). Selezionare i file da esportare tenendo premuto MAIUSC mentre si selezionano i file. Fare clic su File>Esporta… e selezionare la casella Dati non elaborati e quindi la casella Formato AIA. Aprire la scheda Sfoglia progetti all’interno del software di analisi. Fare clic su Database>Importa dati… e selezionare il file esportato. CDF. Una volta importato, vai alla scheda Iniezioni, seleziona i file da analizzare, fai clic con il pulsante destro del mouse e vai a Processo… Nella finestra visualizzata, selezionare la casella di controllo accanto a Processo e selezionare la casella di opzione “Usa metodo di elaborazione specificato” e il metodo di elaborazione desiderato dalla casella di riepilogo a discesa. Nella casella a discesa immediatamente sotto l’etichetta “Come:” selezionare Calibra toscarica e Quantitate. Una volta elaborati, passare alla scheda Risultati e controllare l’integrazione dei cromatogrammi.NOTA: il metodo di elaborazione deve essere verificato per ogni metodo. Come punto di partenza, i parametri utilizzati per il metodo di elaborazione corrente sono inclusi nel file supplementare.NOTA: l’esportazione dei dati può essere eseguita sotto forma di report o solo la quantificazione di picco può essere esportata. Questi possono essere eseguiti nello stesso momento dell’elaborazione o dalla finestra dei risultati. 6. Analisi degli amminoacidi Impostazione della curva standard per la quantificazione assoluta degli amminoacidi da parte di LC-MS Preparare la miscela di aminoacidi estesi (EAA) sciogliendo 59,45 mg di Asn, 59,00 mg di Hyp, 65,77 mg di Gln e 91,95 mg di Trp in 25 mL di 0,1 N HCl. La concentrazione finale di ogni amminoacido nella miscela EAA è di 18 nmol/L. Preparare la soluzione di stock standard interno (IsTD) sciogliendo 58.58 mg di Nva e 44.54 mg di Sar in 50 mL di HCl. Preparare gli standard completi degli amminoacidi combinando la soluzione di stock di amminoacidi contenente Ala, Asp, Arg, Cys, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr, Val a 1 nmol/ , 225, 90, 22,5 e 9 pmol/L. Aggiungere lo stock ISTD preparato agli standard di amminoacidi per una concentrazione finale di 90 pmol/l o 900 pmol/l per creare standard interni “bassi” e “alti” da utilizzare come controlli positivi per il metodo. Collocare le concentrazioni di amminoacidi nelle fiale campione nell’autocampionatore dell’UPLC. Generare una curva di calibrazione (da 9 a 900 pmol/ ) nel software dello strumento in base alle concentrazioni standard di amminoacidi utilizzando le seguenti istruzioni. Utilizzare il Q-ToF in modalità di sensibilità positiva ESI (Electrospray ionizzazione) accoppiato a un UPLC per un’analisi intatta degli amminoacidi. Per la separazione cromatografica, utilizzare una colonna di fase normale fatta per le separazioni di aminoacidi. Preparare i seguenti buffer con reagenti di grado di spettrometria di massa: A – acetonitrile – 0,1% di acido formico e B – 100 mM formato di ammonio. Impostare la portata LC su 0,6 mL/min e la temperatura della colonna su 40 gradi centigradi. Utilizzare le seguenti condizioni di gradiente di 15 minuti per le separazioni degli amminoacidi: 14% B (0-3 min), 14-100% B (3-10 min), 100% B (10-13 min), 100-8% B (13-14 min), 8% B (14-15 min). Utilizzare gli elenchi delle colonne “Tipo campione” e “Conc A” nel programma di acquisizione MS per creare una curva di calibrazione per l’analisi futura dei supporti bioreattori grezzi nel programma di quantificazione. Per fare in modo che queste colonne vengano visualizzate nel programma di acquisizione, utilizzare il comando Personalizza visualizzazione… quando si fa clic con il pulsante destro del mouse sulla barra dei menu superiore. Il tipo di campione per gli standard di amminoacidi sarà “Standard”, mentre i campioni multimediali saranno “Analita”. Compilare la colonna “Conc A” con le concentrazioni numeriche degli standard nelle unità richieste (ad es. pmol/L). Eseguire le concentrazioni standard di amminoacido preparate almeno due volte. Verificare che lo strumento UPLC e lo spettrometro di massa funzionino correttamente controllando i picchi ISTD. Utilizzare l’opzione “Modifica metodo” nell’applicazione di quantificazione per creare il metodo di quantificazione (file con estensione mdb). Definire tutti gli aminoacidi di interesse nell’applicazione di quantificazione, ad esempio il nome composto, il valore m/z e il tempo di conservazione previsto. Modificare qui i parametri di integrazione per il metodo. Utilizzare il metodo dell’amminoacido creato sui campioni standard per creare la curva di calibrazione. Questa curva può essere esportata in un file cdb per l’uso con gli esempi multimediali utilizzando il comando Esporta>Calibrazione…. Nell’applicazione di quantificazione, salvare il layout desiderato in un file con estensione qlt da applicare ai set di dati futuri utilizzando “Salva layout con nome…”. Nome (nome iniezione), Area e Conc sono le colonne di output più importanti. Analisi degli amminoacidi dei supporti bioreattori grezzi da parte di LC-MS Centrifuga supporti bioreattori grezzi a 1.962 x g per 5 minuti e passare attraverso un filtro di 0,22 m. Seguire con una pulizia dell’acido perclororico per rimuovere proteine e particolato: mescolare il supporto filtrato bioreattore con 0.4 N HClO4 a un rapporto 1:1 e centrifugare a 14.700 x g per 5 min a RT. Raccogliere il supporto chiarificato in fiale autocampionatore.NOTA: Regolare il volume di iniezione in base alle esigenze per far rientrare nell’intervallo di calibrazione le concentrazioni di amminoacidi. A seconda dello strumento, il volume di iniezione può essere regolato tra 0,1 e 10 l. Eseguire campioni multimediali in triplice copia di LC-MS. Utilizzare “Process Samples” nel programma di quantificazione insieme al metodo (con estensione mdb) e al file di calibrazione (con estensione cdb). Il metodo e la curva di calibrazione verranno applicati automaticamente ai campioni di supporti grezzi mediante l’applicazione di quantificazione una volta completate tutte le iniezioni. Per esportare i dati per l’analisi in un altro programma (ad esempio un foglio di calcolo), utilizzare il comando “Stampa” e creare un file con estensione xps o pdf.

Representative Results

Il fluido di coltura cellulare raccolto dal bioreattore automatizzato su microscala viene purificato utilizzando la cromatografia liquida a proteina veloce (FPLC), come si è visto nella Figura 1 e gli attributi di qualità critica delle proteine purificate (CQA) sono stati caratterizzati da vari metodi analitici a valle. Questo è un vantaggio chiave del sistema microbioreale automatizzato; le differenze nei CQA possono essere valutate rapidamente in un’ampia gamma di condizioni. I dati N-glycan provenienti da mAbs prodotti da CHO elaborati dalla spettrometria di massa dovrebbero apparire come i cromatogrammi illustrati nella Figura 2. La figura raffigura un confronto tra due cromatogrammi che mostrano che il picco mannose 5 (M5) da un campione è notevolmente inferiore. Se si osserva solo una linea di base rumorosa invece dei picchi, ciò può significare che l’impostazione della cromatografia è difettosa o che la procedura non ha esito positivo. Utilizzando i controlli, la risoluzione dei problemi può essere semplificata. In primo luogo, valutare i picchi DI FLR dalla scala dextran; questi picchi indicano che il sistema cromatico funziona correttamente. Successivamente, confrontare i picchi ottenuti sperimentalmente con quelli ottenuti da uno standard mAb intatto elaborato. Se i picchi dello standard sono visibili, ma non vengono identificati picchi di campione, i campioni mAb non sono stati elaborati correttamente. Ciò può essere dovuto alla presenza di SDS o nucleofilo nel tampone che interferisce con l’etichettatura e la purificazione di N-glicani. SEC-MALS può essere utilizzato per valutare altri due CQA: il profilo di aggregazione e il peso molecolare dell’anticorpo. Un cromatogramma SEC-MALS rappresentativo è paragonabile a quello illustrato nella figura 3. La distribuzione di massa molecolare e il peso molecolare assoluto sono stati determinati utilizzando il software richiesto con un coefficiente di estinzione di 1,37 mL (mg-cm)-1 e un dn/dc di 0,185 mL/g. Poiché le chiamate di picco e l’impostazione della linea di base nel software vengono eseguite manualmente, i risultati possono variare leggermente da utente a utente. Il peso molecolare assoluto del monomerico IgG1 della Figura 3 è 1,504 x 105 Da – 0,38% (blu) e il complesso di ordine superiore è 7,799 x 105 Da – 3,0% (rosso). La polidispersità degli aggregati è molto maggiore di quella del monomero, come indicato dalla distribuzione di massa molare rossa del picco 1 (Figura 3). La piccola quantità di campione e l’importanza dell’aggregazione come CQA rendono questa tecnica uno strumento analitico complementare di grande valore per il sistema microbioretico automatizzato. Il risultato di mC-E è un elettropherogram, come in Figura 4, che mostra il profilo della variante di carica per un anticorpo monoclonale. Il profilo è una firma unica per la proteina in fase di studio ed è altamente sensibile al pH operativo. È visibile anche un picco di tinri liberi a sinistra del profilo della variante di carica. Quando si stabilisce un pH operativo, c’è una certa discrezionalità per l’operatore di bilanciare la risoluzione e il segnale; inoltre, l’operatore deve garantire una buona separazione dal picco di tinture libere che migra a 30 dollari. Il campione può essere dissalato dopo l’etichettatura per rimuovere questo picco, anche se questo porta ad una perdita significativa nel segnale. Una volta stabilito un pH di esercizio, è possibile confrontare i profili campione. Sebbene generalmente coerenti, i cambiamenti nell’efficienza dell’etichettatura o le differenze negli eccipienti possono portare a piccole differenze nella migrazione di un campione e nel profilo della variante di carica che rende gli elettroferigrammi difficili da confrontare direttamente. Invece, il metodo di confronto è di solito basato sulle percentuali delle specie di base, principali e acide. In questo caso, le differenze relative fino all’1-2% possono essere identificate utilizzando mC-E. Il consumo di amminoacidi può essere monitorato per determinare se l’esaurimento sta causando cambiamenti nei CQA. Le letture di croromatogramma dallo spettrometro di massa possono essere utilizzate per valutare la creazione di una curva di calibrazione per la quantificazione assoluta degli amminoacidi nei campioni di supporti bioreattori grezzi. La figura 5 illustra due cromatogrammi ionici totali (TIC) e un cromatogramma iostrai estratto (XIC) come risultati rappresentativi durante questo processo. Nella Figura 5A, il TIC illustrato illustra il segnale di fondo dal sistema di buffer come solo un vuoto d’acqua è stato iniettato. Figura 5 B raffigura un TIC rappresentativo dello standard aminoacido in cui, rispetto al vuoto d’acqua, si possono osservare piccoli picchi che corrispondono alle singole specie di amminoacidi (come la lisina a 7,96 minuti). Per integrare il picco e facilitare la quantificazione dell’area di picco (e quindi la concentrazione), viene utilizzato l’XIC dove viene visualizzato solo il segnale proveniente da una “finestra di massa cromatogramma” definita. A seconda della sensibilità dello strumento e della qualità della separazione cromatica, la finestra di massa ottimale dovrà essere determinata dall’utente. In questo esempio (Figura5C), lo XIC della lisina (m/z – 147.1144) con una finestra di massa di 10 ppm viene visualizzata in cui la lisina nello standard degli amminoacidi eviene dalla colonna a 8,03 minuti. Figura 1 . Cromatogramma rappresentativo dello schema di purificazione utilizzando la tecnica Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). Le fasi del metodo di purificazione corrispondenti al volume (mL) sono etichettate lungo l’asse x. L’assorbimento UV a 280 nm (asse y mAU, linea continua) viene monitorato durante l’intero ciclo di purificazione. Le impurità non specificamente legate vengono spostate aumentando la conduttività (mS/cm asse y, linea tratteggiata) durante l’anticorpo High Salt Wash. (visualizzato). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2. Un cromatogramma a fluorescenza rappresentativo ottenuto da glicani etichettati che vengono verificati in massa. L’asse x è il tempo di ritenzione (minuti) mentre l’asse y è l’intensità del segnale. Il picco a 14,94 min rappresenta il glicano Mannose 5 (M5), dove si può osservare una grande differenza tra la potenza del segnale M5 tra i due campioni sovrapposti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3. Distribuzione del peso molecolare dell’anticorpo monoclonale IgG1. Cromatogramma di un anticorpo monoclonale IgG1 intatto separato da cromatografia di esclusione di dimensioni in 1x PBS (pH7.4). L’assorbimento è monitorato a 280 nm (asse nero; asse sinistro) e sono stati utilizzati rilevatori di indici di dispersione della luce e di rifrazione per calcolare il peso molecolare assoluto di ogni picco (rosso e blu; asse destro). Le specie ad alto peso molecolare sono indicate con il picco etichettato “HMW”. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4 . Profilo variante di carica di un anticorpo monoclonale IgG1. Questo elettroferogramma viene generato su una piattaforma mC-E. Un picco di tinture libere migra a 30 s ed è ben separato dall’IgG1. Per la quantificazione, i picchi sono stati suddivisi in specie di base, principali e acide utilizzando un software di analisi dei dati strumentali. La linea rossa delinea le aree di picco integrate. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5. Risultati rappresentativi dei cromotogrammi ionici per l’analisi degli amminoacidi a base di spettrometria di massa dei supporti bioreattori grezzi. L’asse x è il tempo (minuti) mentre l’asse y è l’intensità del segnale (A) Uno spazio d’acqua funge da controllo negativo e rivela il segnale di fondo osservato nel corso del gradiente di cromatografia liquida (B) Il 225 pmol / amminoacido standard è usato qui come un controllo positivo, come i singoli picchi osservati in questo cromatogramma iosrappresentatore totale rappresentano i diversi aminoacidi della miscela standard in fase di risoluzione cromatograficamente (C) Un rappresentativo cromatogramma iostrai per m /z 147.1144, che è lisina. Il picco di 7,96 min in B corrisponde al picco 8.03 in C di lisina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’HCCF contiene detriti e particelle di grandi dimensioni che possono intasare e distruggere costose strumentazioni, quindi è necessario un chiarimento della coltura prima di un’ulteriore elaborazione a valle. La centrifugazione è generalmente il primo approccio per separare le cellule e altre particelle insolubili dalle proteine seguite dalla filtrazione. Questo HCCF filtrato viene quindi sottoposto alla cromatografia Liquida delle Proteine Veloci (FPLC) per la purificazione. La purificazione dell’HCCF da microbiorifici automatizzati per ottenere il prodotto è un passo importante nella lavorazione a valle. Qui, un sistema FPLC da banco con una colonna proteina A viene utilizzato per ottenere anticorpi monoclonali dall’HCCF. L’analisi per i processi a monte può fornire informazioni utili sul comportamento delle cellule e guidare la progettazione dei bioprocessi, contribuendo a ottenere un prodotto di qualità coerente e affidabile. Analytics ci permette anche di collegare gli attributi di qualità critica (CQA) ai processi a monte e a valle. Qui sono presentati quattro saggi che sono comunemente utilizzati nella caratterizzazione degli anticorpi monoclonali. Queste tecniche sono robuste, affidabili e facilmente dispiegabili per l’analisi dei processi e dei prodotti da una varietà di fonti a monte che sono solo parzialmente purificate e possono ancora contenere livelli residui di DNA e HCP.

Quando si puliscono i campioni per l’analisi, è necessario trovare un importante equilibrio tra la creazione di un campione sufficientemente pulito per l’analisi, preservando al contempo la variabilità presente nel bioreattore. I due contaminanti più comuni che colpiscono il prodotto sono il DNA e l’HCP, che possono essere controllati misurando l’assorbimento del rapporto a 260/280 nm e attraverso SDS-PAGE o .CE-SDS. I saggi qui presentati non sono sensibili a bassi livelli di contenuto di DNA. La purezza del prodotto è pura >95%, come determinato da .CE-SDS.

L’analisi delle varianti di carica con un sistema di elettroforesi microcapillare fornisce un metodo ad alta velocità effettiva per identificare le varianti di carica, con chip e reagenti che sono relativamente facili da implementare. La natura della tecnica e la chimica del reagente di etichettatura sono sensibili sia agli eccipienti che ad altre ammine primarie, richiedendo quindi una fase di salvifica per la maggior parte delle matrici campione. Per esperienza, bassi livelli di co-migrazione del DNA con il colorante libero dalla reazione di etichettatura e non influiscono sulla qualità dei risultati. Mentre la variabilità della quantificazione di picco di base, principale e acida è in genere <1%, livelli più elevati di DNA e altri contaminanti possono aumentare la variabilità del saggio. È estremamente importante essere coerenti con l'etichettatura delle proteine e garantire l'uso tempestivo di DMF dopo la rimozione dalla bottiglia e il composto con il tinrito. Lisina e/o standard di istina sono raccomandati come controlli di etichettatura. Nel corso del tempo e a seconda della qualità del campione, i trucioli possono fallire o perdere il rivestimento sui canali microfluidici, portando a un maggiore rumore, alla presenza di picchi fantasma e a una maggiore variazione da campione a campione. Per identificare questa occorrenza, gli spazi vuoti e uno standard di idoneità del sistema (ad esempio NISTmAb) sono stati analizzati contemporaneamente con i campioni a intervalli regolari. Quando si verificano problemi di trucioli, i trucioli possono essere lavati con la soluzione di stoccaggio o sostituiti.

I metodi utilizzati per l’analisi glicana delle glicoproteine terapeutiche coinvolgono principalmente la cromatografia liquida (LC) e/o la spettrometria di massa (MS), con l’analisi del microarray lectin che guadagna popolarità come terza opzione25. Il metodo descritto in questo documento utilizza sia LC che MS, che presenta vantaggi e svantaggi. I metodi spettrometrici di massa hanno il vantaggio di verificare di massa i glicani analizzati, il che non è possibile con i metodi basati su LC utilizzando un’uscita di rilevamento fluorescente o microarray di lectina. Questo metodo utilizza il rilevamento LC e fluorescenza per assegnare identità glicani utilizzando il confronto del tempo di conservazione a uno standard di scala dextran. Il monitoraggio della fluorescenza consente una maggiore sensibilità e quantificazione grazie alla facilità di rilevazione, dove la sola SM potrebbe non essere in grado di quantificare le specie a bassa abbondanza a causa della scarsa efficienza ionizzazione degli oligosaccari. Le informazioni di massa provenienti dalla SM vengono utilizzate per confermare le identità glican, ma il software di elaborazione non utilizza le informazioni di massa come criteri di assegnazione primari. Quindi, senza cromatografia riproducibile e picchi facilmente risolvibili, questo metodo può soffrire per quanto riguarda le assegnazioni di glicani. Fortunatamente, le informazioni di massa possono aiutare con le assegnazioni di glicani anche in situazioni in cui la cromatografia è scadente, come i cambiamenti nel tempo di ritenzione che ostacolano le assegnazioni di glicani riproducibili. Se questo metodo viene utilizzato senza SM, la cromatografia deve essere al livello più alto poiché le informazioni di massa non possono essere utilizzate per correggere la deriva del tempo di soggiorno.

Il metodo di analisi degli amminoacidi qui descritto utilizza LC-MS per la rapida quantificazione di aminoacidi non derivati nei media di coltura cellulare grezza. I metodi alternativi di analisi degli amminoacidi richiedono agenti di derivazione degli amminoacidi per abilitare il rilevamento UV26. Il metodo LC-MS offre importanti vantaggi rispetto al metodo LC-UV: consente l’identificazione in base sia al tempo di ritenzione che alla massa di ioni rispetto al metodo LC-UV, che è limitato dalla mancanza di caratterizzazione di massa. Inoltre, il metodo LC-MS offre vantaggi in termini di tempo e riproducibilità, in quanto il metodo LC-UV richiede una reazione di derivazione che richiede molto tempo, che può impartire variabilità del campione27. Tuttavia, l’iniezione di supporti per la coltura delle cellule grezze nel metodo LC-MS può causare effetti nocivi sul segnale MS a causa dell’incrostazione dello skimmer io. Una scala di calibrazione viene iniettata frequentemente come un controllo di idoneità del sistema e l’ordine dei campioni viene randomizzato per evitare distorsioni nei dati.

Il processo di coltura cellulare per la produzione di anticorpi mediante microbioriche è descritto in precedenza9. In questo studio, i protocolli dettagliati per i metodi di caratterizzazione dell’anticorpo monoclonale che massimizzano i dati acquisiti da volumi di campioni limitati sono ben definiti. Quantità limitate di fluido di coltura cellulare raccolte possono talvolta limitare le informazioni sui prodotti acquisite e la selezione delle giuste procedure analitiche per ottenere i dati sulla qualità del prodotto è essenziale. Le analisi sono importanti per collegare i parametri di processo a monte alle variazioni della qualità del prodotto. Qui, è prevista una linea guida per gli utenti per caratterizzare mAbs quando si lavora con microbiorici.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gli autori desiderano ringraziare Scott Lute per il supporto analitico che ha fornito. Il finanziamento interno parziale e il sostegno a questo lavoro sono forniti dal CDER Critical Path Program (CA #1-13). Questo progetto è sostenuto in parte da un appuntamento al programma di partecipazione tirocinio/ricerca presso l’Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, amministrato dall’Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell’Energia degli Stati Uniti e la FDA.

Materials

CHO DG44 Cell Line Invitrogen A1100001
Akta Avant 25 General Electric Life Sciences 28930842
Pro Sep vA Ultra Chromatography Resin Millipore Sigma 115115830 Purification Stationary Phase
Omnifit 10cm Column Diba Fluid Intelligence 006EZ-06-10-AA Housing for Stationary Phase
Tris Base Fisher Scientific BP154-1
Superloop 10 mL GE Healthcare 18-1113-81
µDawn Multi Angle Light Scattering Detector Wyatt WUDAWN-01
0.22 µm Millex GV Filter Unit PVDF Membrane Merck Millipore SLGV033RB
10X Phosphate Buffered Saline Corning 46-013-CM
12 mL Syringe Covidien 8881512878
1290 Infinity Binary Pump Agilent Technologies G4220A
1290 Infinity DAD  Agilent Technologies G4212A
1290 Infinity Sampler Agilent Technologies G4226A
1290 Infinity Thermostat Agilent Technologies G1330B
1290 Infinity Thermostatted Column Compartment Agilent Technologies G1316C
15 mL Falcon tube Corning Inc. 352097
150 uL Glass Inserts with Polymer Feet  Agilent Technologies 5183-2088
50 mL Falcon tube Corning Inc. 352070
96-Well Plate Bio-Rad 127737
Acetic Acid Sigma-Aldrich 695072
Acetonitrile Fisher Chemical BPA996-4
ACQUITY I-Class UPLC BSM Waters Corporation 18601504612
ACQUITY I-Class UPLC Sample Manager Waters Corporation 186015000
ACQUITY UPLC FLR Detector Waters Corporation 176015029
Amicon Ultra-4 100 kDa centrifugal filters Merck Millipore UFC810096
Amino Acid Standard, 1 nmol/µL  Agilent Technologies 5061-3330
Amino Acid Supplement Agilent Technologies 5062-2478
Ammonium Formate Solution – Glycan Analysis Waters Corporation 186007081
Blue Screw Caps with Septa Agilent Technologies 5182-0717
CD OptiCHO AGT Medium Thermo Fisher Scientific A1122205
Centrifuge Tubes Eppendorf 22363352
Charge Variant Chip Perkin Elmer 760435
Charge Variant Reagent Kit Perkin Elmer CLS760670
Chromatography Water (MS Grade) Fisher Chemical W6-4
Dimethylformamide Thermo Scientific 20673
Extraction Plate Manifold for Oasis 96-Well Plates Waters Corporation 186001831
Formic Acid Fisher Chemical A117-50
GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit – 24 Sample Waters Corporation 176003712
GXII Buffer Tubes E&K Scientific 697075- NC
GXII Detection Window Cleaning Cloth VWR 21912-046
GXII HT Touch Perkin Elmer CLS138160
GXII Ladder Tubes Genemate C-3258-1
GXII Lint-Free Swab ITW Texwipe TX758B
Hydrochloric Acid Fisher Scientific A144-500
Intact mAb Mass Check Standard Waters Corporation 186006552
Intrada Amino Acid Column 150 x 2 mm Imtakt WAA25
NanoDrop One Microvolume UV-Vis Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 840274100
Optilab UT-rEX Differential Refractive Index Detector Wyatt WTREX-11
Perchloric acid Aldrich Chemistry 311421
Pipet Tips with Microcapillary for Loading Gels Labcon 1034-960-008
Polypropylene 96-Well Microplate, F-bottom, Chimney-style, Black Greiner Bio-One 655209
RapiFlour-MS Dextran Calibration Ladder Waters Corporation 186007982
Screw Top Clear Vial 2mL Agilent Technologies 5182-0715
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-1
Sodium Iodide Sigma Aldrich 383112
TSKgel UP-SW3000 4.6mm ID x 30 cm L Tosoh Biosciences 003449
UNIFI Scientific Information System Waters Corporation 667005138
Vacuum Manifold Shims Waters Corporation 186007986
Vacuum Pump Waters Corporation 725000604
Xevo G2 Q-ToF Waters Corporation 186005597
Zeba Spin Desalting Column, 0.5 mL Thermo Scientific 89883

References

  1. . . Pharmaceutical cGMPs for the 21st Century: A Risk-Based Approach. , (2004).
  2. New Molecular Entity (NME) Drug and New Biologic Approvals. FDA Available from: https://www.dfa.gov/Drugs/DevelopmentApprovalProcess/HowDrugsareDevelopedandApproved/DrugandBiologicAprrovalReports/NDAandBLAApprovalReports/ucm373420.htm (2015)
  3. Foltz, I. N., Karow, M., Wasserman, S. M. Evolution and Emergence of Therapeutic Monoclonal Antibodies. Circulation. 127, 2222-2230 (2013).
  4. Kondragunta, B., Drew, J. L., Brorson, K. A., Moreira, A. R., Rao, G. Advances in clone selection using high-throughput bioreactors. Biotechnology Progress. 26 (4), 1095-1103 (2010).
  5. Hmiel, L., Brorson, K., Boyne, M. Post-translational structural modifications of immunoglobulin G and their effect on biological activity. Analytical & Bioanalytical Chemistry. 407 (1), 79-94 (2015).
  6. Rathore, A. S. Roadmap for implementation of quality by design (QbD) for biotechnology products. Trends in Biotechnology. 27 (9), 546-553 (2009).
  7. . International Council for Harminisation of Techinical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH. , (1999).
  8. Berkowitz, S. A., Engen, J. R., Mazzeo, J. R., Jones, G. B. Analytical tools for characterizing biopharmaceuticals and the implications for biosimilars. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (7), 527-540 (2012).
  9. Velugula-Yellela, S. R., et al. Use of high-throughput automated microbioreactor system for production of model IgG1 in CHO cells. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  10. Largy, E., Cantais, F., Van Vyncht, G., Beck, A., Delobel, A. Orthogonal liquid chromatography-mass spectrometry methods for the comprehensive characterization of therapeutic glycoproteins, from released glycans to intact protein level. Journal of Chromatography A. 1498, 128-146 (2017).
  11. Yang, J. -. M., et al. Investigation of the correlation between charge and glycosylation of IgG1 variants by liquid chromatography-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 448, 82-91 (2014).
  12. Agarabi, C. D., et al. Bioreactor Process Parameter Screening Utilizing a Plackett-Burman Design for a Model Monoclonal Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1919-1928 (2015).
  13. Wen, J., Arakawa, T., Philo, J. S. Size-Exclusion Chromatography with On-Line Light-Scattering, Absorbance, and Refractive Index Detectors for Studying Proteins and Their Interactions. Analytical Biochemistry. 240 (2), 155-166 (1996).
  14. Veurink, M., Stella, C., Tabatabay, C., Pournaras, C. J., Gurny, R. Association of ranibizumab (Lucentis) or bevacizumab (Avastin) with dexamethasone and triamcinolone acetonide: An in vitro stability assessment. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 78 (2), 271-277 (2011).
  15. Li, Y., Weiss, W. F., Roberts, C. J. Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi-angle laser light scattering. Journal of Pharmaceutical Sciences. 98 (11), 3997-4016 (2009).
  16. Espinosa-de la Garza, C. E., et al. Analysis of recombinant monoclonal antibodies by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis. 34 (8), 1133-1140 (2013).
  17. Han, H., Livingston, E., Chen, X. High throughput profiling of charge heterogeneity in antibodies by microchip electrophoresis. Analytical Chemistry. 83 (21), 8184-8191 (2011).
  18. Wheeler, T. D., et al. Microchip zone electrophoresis for high-throughput analysis of monoclonal antibody charge variants. Analytical Chemistry. 86 (11), 5416-5424 (2014).
  19. Carrillo-Cocom, L., et al. Amino acid consumption in naive and recombinant CHO cell cultures: producers of a monoclonal antibody. Cytotechnology. 67 (5), 809-820 (2015).
  20. Chen, P., Harcum, S. W. Effects of amino acid additions on ammonium stressed CHO cells. Journal of Biotechnology. 117 (3), 277-286 (2005).
  21. Xing, Z., et al. Optimizing amino acid composition of CHO cell culture media for a fusion protein production. Process Biochemistry. 46 (7), 1423-1429 (2011).
  22. Fan, Y., et al. Amino acid and glucose metabolism in fed-batch CHO cell culture affects antibody production and glycosylation. Biotechnology and Bioengineering. 112 (3), 521-535 (2015).
  23. Read, E. K., et al. Fermentanomics informed amino acid supplementation of an antibody producing mammalian cell culture. Biotechnology Progress. 29 (3), 745-753 (2013).
  24. Mazzer, A. R., Perraud, X., Halley, J., O’Hara, J., Bracewell, D. G. Protein A chromatography increases monoclonal antibody aggregation rate during subsequent low pH virus inactivation hold. Journal of Chromatography. A. 1415, 83-90 (2015).
  25. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. MAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  26. Wahl, O., Holzgrabe, U. Amino acid analysis for pharmacopoeial purposes. Talanta. 154, 150-163 (2016).
  27. Le, A., Ng, A., Kwan, T., Cusmano-Ozog, K., Cowan, T. M. A rapid, sensitive method for quantitative analysis of underivatized amino acids by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Journal of Chromatography B. 944, 166-174 (2014).

Play Video

Cite This Article
Velugula-Yellela, S. R., Powers, D. N., Angart, P., Faustino, A., Faison, T., Kohnhorst, C., Fratz-Berilla, E. J., Agarabi, C. D. Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System. J. Vis. Exp. (147), e58947, doi:10.3791/58947 (2019).

View Video