T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

本研究では 6-8 週齢のオスとメスの c57bl/6 マウスは使用されました。シンガポール国立大学 (シンガポール) での動物実験施設で飼育されたマウス。シンガポール国立大学制度アニマル ・ ケアおよび使用委員会 (IACUC)、すべての動物実験を承認しました。 1. 胸腺細胞懸濁液の準備 CO2チャンバーにマウスを安楽死させます。 細胞培養の汚染を避けるためにティッシュ文化フードの後続の手順を実行します。マウス死体解剖基板にピンを使用してセキュリティで保護された、70% エタノールでマウスをスプレーします。 はさみのペアを使用して、顎に向かって腹部腹側縦切開を行います。さらに後ろ足の各々 に沿って切開を加えます。胸郭を公開し、それを突き止めるのために皮膚をストレッチします。 はさみのペアで横隔膜と肋骨後端からの両側をカットします。胸郭を持ち上げて公開胸腺にピンします。胸腺を結び付ける結合組織を分離・ カーブタイプ鉗子のペアを使用して胸腺を抽出します。 5 mL の完全な RPMI 培を含む 6 ウェル プレートのウェルに胸腺を配置します。注: を考慮 10% 炭除去牛胎児血清 (FBS) を場合長い胸腺細胞生存率を改善するためにメディアに追加する郭清と刺激試験の間の待ち時間を期待します。 優しく、注射器の鈍い端を使用して、胸腺をマッシュ アップして、70 μ M の細胞ストレーナーをセルを通過します。また、健康的な状態で胸腺細胞を収集する胸腺上皮から流れ、胸腺を絞るし、胸腺細胞を収集する鉗子の 2 つのペアを使用して検討してください。 診断または楽器を数える自動セルを使用してセルのカウントに進みます。 2. 毒性濃度キナーゼ阻害剤の滴定 注: このセクションは、T 細胞の活性化の画面で使用する阻害剤を準備に焦点を当てください。阻害剤は高濃度で使用は、T 細胞活性化スクリーンの読み出しである細胞死を引き起こすことができます。阻害剤の希釈液のシリーズを目指す TCR 刺激から独立してアポトーシスを誘導する必要があります個々 の阻害剤の最終濃度を決定します。本研究で使用されるキナーゼ阻害剤のライブラリは、外部のベンダーから購入しました。阻害剤のリストは、テーブルの材料に含まれます。 低濃度でキナーゼ阻害剤のプレートの準備 阻害剤 1 mM の板を準備するには、ジメチルスルホキシド (DMSO) すべての阻害剤の 90 μ L に阻害剤の 10 μ L を追加します。注: 本研究で使用される低分子ライブラリから阻害剤は、10 mM のストック濃度で来る。阻害剤が餌の形態にある場合、サプライヤーから推奨再構成手順に従います。阻害剤が 10 mM でない場合、代わりに、代替の適切な濃度で阻害剤プレートを準備し、適切な希釈倍率と阻害剤の別のシリアル希薄を準備します。注意: 毒性阻害剤の場合は、安全な取り扱いと廃棄に製造元の指示に従ってください。 阻害剤 0.1 mM のプレートを準備するには、DMSO の 90 μ L に 1 mM 阻害剤のプレートから阻害剤の 10 μ L を追加します。 0.01 mM で阻害剤のプレートを準備するには、DMSO の 90 μ L に阻害剤 0.1 mM の板から阻害剤の 10 μ L を追加します。 胸腺細胞キナーゼ阻害剤の治療 セクション 1 に従って胸腺細胞懸濁液を準備します。 5 x 10 の6セル/mL の胸腺細胞懸濁液を取得する完全な RPMI 胸腺細胞を希釈します。 96 ウェル プレート、マルチ チャンネル ピペットを使用してのすべてのウェルに胸腺細胞懸濁液 200 μ L を追加します。 各ウェルにも 1 mM 阻害 (抑制剤の最終濃度は 10 μ M) を含むプレートへの対応から阻害剤の 2 μ L を追加します。 同じ板で DMSO の 2 μ L の追加によって未処理のコントロールの 4 つの井戸、5 μ M デキサメサゾン治療ポジティブ コントロール、4 つの井戸、マイナス コントロールの車両処理の 4 つの井戸を準備します。 37 ° c、5% CO2インキュベーター 17-20 h の胸腺細胞を孵化させなさい (または夜通し)。 個々 の阻害剤の適切な濃度の定量 300 x gで胸腺の皿を回し、4 ° C、5 分は、FACS 洗浄バッファーの 250 μ L で細胞を再懸濁します。 サンプルのフローサイトを実行し、流れフローサイトメトリー解析プログラムで結果を分析します。 FSC SSC ゲートに基づいて生きているセルの割合を決定します。ゲートの戦略を図 1 bに示します。 100% で正規化されます DMSO 処理コントロールに基づいて生きているセルの割合の平均値を計算します。許容可能な細胞死 (e.g.,20%) の任意のウィンドウを設定します。このウィンドウ (すなわち.、DMSO 処理コントロールの 80% 以下) の下の生きているセルの割合を発生させた阻害剤は、低濃度で再テストすることです。 2.3.4 のステップの実行可能性の基準を通過しなかった阻害剤、手順 2.2.1 – 2.3.4, からの手順を繰り返しますが、0.1 mM で 1 mM 阻害剤を含むプレートではなくステップ 2.2.4 で阻害剤のプレートを使用します。ここで使用される抑制剤の最終濃度は 1 μ M です。 まだ 1 μ M で細胞死の高レベルを生成、0.1 μ M で阻害剤をテストする阻害剤の 2.2.1 – 2.3.4,、手順ステップ 2.2.4 で 0.01 mM で阻害剤のプレートを使用します。ここで使用される抑制剤の最終濃度は、0.1 μ M です。 キナーゼ阻害剤のストック プレートの準備 10 μ M で使用する阻害剤、DMSO の 10 μ L を 10 mM 阻害剤の 10 μ L を追加します。 1 μ M で使用する阻害剤、DMSO の 19 μ L に 10 mM の阻害剤の 1 μ L を追加します。 0.1 μ M で使用する阻害剤、DMSO (図 1) の 199 μ L に 10 mM 阻害剤の 1 μ L を追加します。注: 阻害剤の準備のストック プレートは胸腺細胞懸濁液に追加する目的の最終濃度濃度 × 500 です。阻害剤のストック プレートは、PCR ストリップまたは 96 ウェル プレートで用意できます。 キナーゼ阻害剤のストック プレートは、従来の遠心分離に依存したシステム (セクション 3; 参照図 1 a方法 1 および 2)、または代替の遠心分離独立システム (セクション 4; 参照胸腺細胞のスクリーニングのために適用できます。図 1 a、方法 3)。 3 キナーゼ阻害剤ライブラリ (従来型遠心分離機を用いた測定) をスクリーニング 胸腺細胞キナーゼ阻害剤の治療 セクション 1 に従って胸腺細胞懸濁液を準備します。 5 x 10 の6セル/mL の胸腺細胞懸濁液を取得する完全な RPMI 胸腺細胞を希釈します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して 96 ウェル プレートの各ウェルに胸腺細胞の 200 μ L を追加します。氷の上の皿を配置します。 セクション 2.4 で 0.5 μ L 阻害剤のストック プレートの対応する井戸から 96 ウェル プレートに阻害剤の準備に追加します。 8 井戸の未処理のコントロールを準備します。DMSO の 0.5 μ L を追加することによって、車両処理コントロールの 4 つの井戸を準備します。5 μ M デキサメサゾン治療コントロール (図 2) の 4 つの井戸を準備します。 抗 CD3/CD28 ビーズを用いた胸腺細胞の刺激 ビーズの 1 mL をとり、2 ml の PBS のビーズを洗浄します。磁気スタンドを使用してビーズを分離し、ソリューションを吸引します。完全な RPMI 5 mL にビーズを再懸濁します。注: セルにビーズの比は、1 〜 2.5 です。刺激する井戸の数と使用される胸腺細胞数に応じて実行するビーズの量を調整します。 各阻害剤のサンプル、4 つの DMSO 処理サンプル、および 8 個の未処理のサンプルの 4 つにビーズの 50 μ L を追加します。残りの 4 つの未処理井戸に完全な RPMI の 50 μ L を追加します。図 2は、プレートの一般的なレイアウトを示します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸の内容をミックスします。 37 ° c、5% CO2インキュベーター 17-20 h の胸腺細胞を孵化させなさい (または夜通し)。 細胞表面抗原の染色 反 TCRβ、抗 cd4 抗体、抗 CD8、アンチ CD69 抗体を含む抗体染色混合物を準備します。1: 200 (v/v) の割合で FACS 洗浄バッファー (0.5% ウシ血清アルブミン [BSA] を添加した PBS) の抗体を希釈します。注: は、異なる実験で染色の変動を最小限に抑えるため、信号対雑音比を改善するために、固定抗体の希薄を使用する代わりに、染色用抗体の最適化を検討します。 300 × gで 5 分のための 4 ° C のプレートをスピンします。 液を捨てプレートをフリックします。 プロトコルは、従来の遠心分離機依存プロトコルを従うことができますこの時点で (3.3.5 ステップへ進みます;図 1 a方法 1 を参照してください) または代替の遠心分離に依存しないプロトコル (4.4.4 をステップへ進みます;図 1 aメソッドを参照してください2)。 3.3.1 準備した染色の抗体の混合物の 75 μ L で細胞を再懸濁します。 マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルを混ぜ、30 分間氷の上にそれらを孵化させなさい。 細胞の固定 FACS 洗浄バッファーの 200 μ L で井戸を洗浄し、 gおよび 4 ° C、5 分 × 300 でプレートをスピンします。 液を捨てプレートをフリックします。 固定/透過バッファーを追加 (アクティブなカスパーゼ 3 アポトーシス キットが付属してパーマ/洗浄バッファー x 10 と同じで述べたステップ 3.5.1 3.5.2 の手順でアンチ カスパーゼ 3 抗体) 200 μ L/ウェルで。 氷上で 30 分間インキュベートします。 アクティブなカスパーゼ 3 のために汚れる細胞内 1 x パーマ/洗浄バッファーを準備するには、5 mL の超純水水 45 mL に 10 の x パーマ/洗浄バッファーを希釈します。 パーマ/洗浄バッファー x 1 6.5 mL にアンチ カスパーゼ 3 抗体の 1.3 mL を追加することによって細胞内のアクティブなカスパーゼ汚れを準備します。パーマ/洗浄バッファーに対する抗体の比は 1:5 です。 300 x gでプレートをスピンし、4 ° C、5 分フリック ソリューションを破棄するプレート。1 x パーマ/洗浄バッファーの 200 μ L で洗浄します。 3.5.3 のステップを繰り返します。 300 x gでプレートをスピンし、4 ° C、5 分フリック ソリューションを破棄するプレート。細胞内のカスパーゼ染色手順 3.5.2 すべての井戸で準備の 75 μ L を追加します。 マルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、氷上で 1 時間インキュベートします。 1 x パーマ/洗浄バッファーの 200 μ L のサンプルを洗って 300 × gで 5 分のための 4 ° C のプレートをスピンします。 液を捨てプレートをフリックします。1 x パーマ/洗浄バッファーの 200 μ L で洗浄します。300 × gで 5 分のための 4 ° C のプレートをスピンします。 液を捨て、FACS 洗浄バッファーの 200 μ L のサンプルを再懸濁しますにプレートをフリックします。 サンプルのフローサイトを実行し、FACS 解析プログラムで結果を分析します。 CD4 および CD8 の肯定的な表現と DP 胸腺細胞の人口にゲート CD4とCD8 プロットを使用すると、(図 2、下半分)。DP 胸腺細胞ゲート内で活性化されたカスパーゼ 3、陽性対照としてネガティブ コントロールとデキサメタゾン処理サンプルを使用して細胞の割合を決定します。DP 胸腺細胞ゲートで CD69 の表現の分析のため肯定的な制御として負の制御および刺激のサンプルとして些細のサンプルを使用します。注: DP 胸腺細胞のゲーティングしているとき、は、DP 胸腺細胞の人口は個々 のサンプルのため正しく区切られてことを確認します。刺激細胞レセプター表面コレセプターおよびイベントの意図しない除外は、タイトな DP のゲートを使用する場合に発生します。 4. キナーゼ阻害剤ライブラリ (遠心分離独立スクリーニングアッセイ) 胸腺細胞キナーゼ阻害剤の治療 セクション 1 に従って胸腺細胞懸濁液を準備します。 25 x 106セル/mL の胸腺細胞懸濁液を取得する完全な RPMI で胸腺細胞を希釈します。 マルチ チャンネル ピペットを使用して少量プレートの各ウェルに胸腺細胞の 40 μ L を追加します。氷の上の皿を配置します。 ストック プレート、DMSO、および完全な RPMI の 4 つの部分の比率で完全に RPMI でデキサメタゾンから阻害剤/DMSO/デキサメタゾン (5 倍希釈) の一部に阻害剤を希釈します。注: この小さなボリューム プレートで使用されるボリュームは従来より小さい x 5、阻害剤およびコントロール試薬が希釈プレートの胸腺細胞にそれらを追加する前に 5 倍。 4.1.4 準備した阻害剤板の対応する井戸から 96 ウェル プレートに阻害剤の 0.5 μ L を追加します。 8 井戸の未処理のコントロールを準備します。4.1.4 準備した DMSO の 0.5 μ L を追加することによって、車両処理コントロールの 4 つの井戸を準備します。5 μ M デキサメサゾン治療コントロールの 4.1.4 (図 2) のステップで準備希薄化後のデキサメタゾンを使用して 4 つの井戸を準備します。 抗 CD3/CD28 ビーズを用いた胸腺細胞の刺激 ビードが均一に再停止されることを確認します。ビーズの 1 mL をとり、2 mL の PBS で洗浄します。磁気スタンドを使用してビーズを分離し、ソリューションを吸引します。完全な RPMI 1 mL にビーズを再懸濁します。注: セルにビーズの比は、1 〜 2.5 です。刺激する井戸の数や使用される胸腺細胞の数によって、ビーズの量を調整します。 各阻害剤のサンプル、4 つの DMSO 処理サンプル、および 8 個の未処理のサンプルの 4 つにビーズ懸濁液の 10 μ L を追加します。残りの 4 つの未処理井戸に完全な RPMI の 10 μ L を追加します。図 2は、一般的なプレート レイアウトを示しています。注: 井戸の最終巻は 50 μ L、井戸の最大の容量であります。注意を行使して直立した、クロスも流出を避けるためにプレートを保持するために重要です。 ミックス、マイクロ プレート軌道シェーカーを使用してプレートを揺り動かしなさい。また、マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸の内容をミックスします。 37 ° c、5% CO2インキュベーター 17-20 h の胸腺細胞を孵化させなさい (または一晩) 反蒸発ふた付き。 プレート洗浄機のセットアップ注: プレート ワッシャーをセットアップする手順は、製造元によって提供されます。手順は、簡単に言うと以下に記載されています。約 150 mL の溶液は、ごとのプライミングの手順が必要です。 含有 1% 70% エタノールで洗浄システムをプライム トゥイーン 20。 1% を含む脱イオン水洗浄システムをプライム トゥイーン 20。 プライム FACS 洗浄バッファーで洗浄システム。 細胞表面抗原の染色 反 TCRβ、抗 cd4 抗体、抗 CD8、アンチ CD69 抗体を含む抗体染色混合物を準備します。1: 100 (v/v) の割合で FACS 洗浄バッファーで抗体を希釈します。 プレート 9 x、洗浄、洗浄システム自動化された層流を用いたあたり FACS 洗浄バッファーの 55 μ L を使用して洗ってください。注意: 洗浄の最後に、各ウェルに残気量を 25 μ l 添加があるでしょう。 4.4.1 のステップで準備染色抗体の混合物の 25 μ L で細胞を再懸濁します。 サンプルを (ステップ 3.3.4) から 96 ウェル プレートから転送した場合 3.3.1 の手順で作製した抗体の混合物の 50 μ L で細胞を再懸濁し、サンプルを少量プレートに転送します。この手順は、図 1 aに示されている、メソッド数 2 に対応します。 ミックス、軌道マイクロ プレート シェーカーにプレートを扇動またはマルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、氷上で 30 分間インキュベートします。 細胞の固定 プレート 9 x、洗浄、洗浄システム自動化された層流を用いたあたり FACS 洗浄バッファーの 55 μ L を使用して洗ってください。 固定/透過バッファーを追加 (アクティブなカスパーゼ 3 アポトーシス キットが付属していますパーマ/洗浄バッファー x 10 と同じで述べたステップ 4.6.1 ステップ 4.6.2 でアンチ カスパーゼ 3 抗体) ウェルあたり 50 μ L で。 氷上で 30 分間インキュベートします。 アクティブなカスパーゼ 3 のために汚れる細胞内 225 mL の純水で 10 x パーマ/洗浄バッファーの 25 mL を希釈して 1 x パーマ/洗浄バッファーを準備します。 パーマ/洗浄バッファー x 1 の 2 mL にアンチ カスパーゼ 3 抗体の 1 つの mL を追加することによって細胞内のアクティブなカスパーゼ汚れを準備します。パーマ/洗浄バッファーに対する抗体の比率は 1:2 です。 プライム パーマ/洗浄バッファー × 1 洗浄システム。 9、洗浄各洗浄のため 55 μ L でのパーマ/洗浄バッファー x 1 x。 すべての井戸にステップ 4.6.2 で準備細胞内のカスパーゼ汚れの 25 μ L を追加します。 ミックスするには、軌道マイクロ プレート シェーカーにプレートを扇動またはマルチ チャンネル ピペットを使用してサンプルをミックスし、氷上で 1 時間インキュベートします。 9、洗浄各洗浄のため 55 μ L でのパーマ/洗浄バッファー x 1 x。 すべての井戸に FACS 洗浄バッファーの 25 μ L を追加します。 マイクロタイター チューブに十分な混合によるピペッティングした後サンプルを転送します。 空井戸に FACS 洗浄バッファーの別の 50 μ L を追加し、手順 4.6.9. 4.6.9 と 4.6.10 手順を繰り返します 2 倍マイクロタイター チューブで 200 μ L のサンプルが収集されるまで。注: 4.6.10 と 4.6.11 の手順で説明されている手順の目的は、小ボリューム プレートからセルの最大回復を確保するためです。セル番号をステップ 4.6.10 後心配ない場合、単のトップアップ、マイクロタイター チューブ FACS 洗浄バッファーで 200 μ L。 サンプルのフローサイトを実行し、ステップ 3.5.11 に従っての FACS 解析プログラムで結果を分析します。カスパーゼ 3 活性化と CD69 式 CD4 を含むゲートで分析し、+CD8+DP 胸腺細胞。