Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi¹. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello², e la presenza o l’assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termine e dynamics delle vescicole sinaptiche^{3, 4 , 5}. Pertanto, è di vitale importanza per essere in grado di identificare la presenza di diverse proteine sinaptiche tra aree del cervello.

I metodi di scelta per la quantificazione delle proteine sinaptiche – finora – sono di spettrometria di massa e Western blotting, piuttosto che immunohistochemistry^6,7,8,9. In alcuni casi, vengono utilizzati diversi metodi per completarsi a vicenda per valutare sia la quantità e la localizzazione delle proteine specifiche (cioè, Wilhelm et al. ¹⁰). il metodo qui descritto consente per la localizzazione e la quantificazione delle proteine di interesse senza la necessità di utilizzare qualsiasi metodo di biochimica, semplicemente che impiegano gli stainings immunofluorescenti. Un altro vantaggio è che la quantificazione può essere fatto su aree molto più piccoli e, dunque, più specifico, rispetto a quelli realizzati con altri metodi. Tuttavia, uno deve prendere in considerazione che una proteina di riferimento affidabile è necessario per valutare la distribuzione della proteina di interesse.

Macchiatura fluorescente da immunohistochemistry permette di identificare sistematicamente la localizzazione delle proteine attraverso aree cerebrali, così come all’interno di diversi compartimenti neuronali. Per identificare i diversi compartimenti, vengono utilizzati gli indicatori specifici. In genere, anticorpi contro la sinapsina e lo synaptophysin¹¹ possono essere usati per etichettare le vescicole sinaptiche, mentre gli anticorpi contro fagotto etichettare la zona attiva di un terminale presinaptico¹². Trasportatori vescicolari, quali i trasportatori del glutammato vescicolare dei suini (vGluT) o il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT), vengono utilizzati per etichettare eccitatorio¹³ e inibitorio¹⁴ terminali presinaptici, rispettivamente. Sul versante postsinaptico, anticorpi contro la proteina Homer possono essere impiegati per contrassegnare terminali postsinaptici e anticorpi contro densità postsinaptica proteina 95 (PSD95)^15,16,17 o gephyrin^{18 , 19 , 20} può etichettare terminali postsinaptici eccitatori o inibitori, rispettivamente. Usando gli anticorpi contro una proteina di interesse e marcatori come quelle descritte sopra, si può determinare la localizzazione di tali proteine. Molti studi fino ad oggi hanno fatto questo in un modo qualitativo²¹. Tuttavia, per determinare in modo affidabile la distribuzione differenziale di una specifica proteina sinaptica, si deve non solo determinare la presenza o assenza, ma anche la concentrazione relativa. L’eterogeneità di dimensioni e densità delle sinapsi lo rende importante per stabilire un rapporto tra il marcatore sinaptico e la proteina di interesse. In caso contrario, sinapsi ricche regioni quali gli strati non-piramidali dell’ippocampo e strato molecolare del cervelletto mostrerà un’alta densità di proteine sinaptiche, solo a causa della maggiore densità delle sinapsi, ma non a causa di una forte presenza di quella proteina in ogni sinapsi (ad es., Wallrafen e Dresbach¹). D’altra parte, proteine in soma neuronale (ad es., TGN38²²) di solito mostrano forte presenza nella strato delle cellule piramidali hippocampal o strato delle cellule ippocampali o cerebellari del granello dovuta all’alta concentrazione di corpi delle cellule neuronali in quelle zone. Pertanto, questa distribuzione non omogenea delle strutture, in questo caso le sinapsi, può portare a una falsa stima della distribuzione della proteina di interesse stesso. Inoltre, vi è un’intrinseca variabilità nell’intensità di colorazione attraverso campioni in stainings immunohistochemical. Il protocollo descritto qui prende questo in considerazione ed evita tali pregiudizi, come pure altri avvertimenti che derivano da metodi immunohistochemical.

Nel nostro recente studio, abbiamo utilizzato questo metodo per descrivere l’espressione differenziale di Mover (chiamato anche TPRGL²³ o SVAP30²⁴) attraverso 16 di aree differenti del cervello¹. Mover è una proteina sinaptica di vertebrato-specifico che può essere trovata in associazione a vescicole sinaptiche ed influenze neurotrasmettitore rilascio^25,26,27. Abbiamo abbiamo riferito l’espressione Mover per l’abbondanza delle vescicole sinaptiche, macchiando per lo synaptophysin come un marcatore di riferimento delle vescicole sinaptiche. Abbiamo trovato alti livelli di Mover in particolare i nuclei settali, pallidum ventrale e l’amigdala. All’interno dell’ippocampo, abbiamo trovato una distribuzione eterogenea di Mover, con alti livelli negli strati connessi con calcolo intra-ippocampale e bassi livelli in livelli di ingresso e di uscita.