Summary

Medidas solo de liposomas para el estudio de enzimas de membrana bombas de protones usando electroquímica y microscopia fluorescente

Published: February 21, 2019
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Summary

Aquí, presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo molecular de la translocación de protones a través de membranas lipídica de liposomas sola, usando citocromo bo3 como ejemplo. Combinación electroquímica y microscopia de fluorescencia, cambios en el pH en el lumen de las vesículas individuales, contienen solo o múltiples enzimas, puede ser detectado y analizado individualmente.

Abstract

Enzimas bombas de protones, de electrones de transferencia cadenas par redox las reacciones de translocación de protón a través de la membrana, creando una fuerza protón-motriz utilizada para la producción de ATP. La naturaleza anfifílicas de proteínas de membrana requiere especial atención para su manejo y reconstitución en el medio lipídico natural es indispensable en el estudio de procesos de transporte de membrana como la translocación de protones. Aquí detallamos un método que se ha utilizado para la investigación del mecanismo de bombeo de protones de las enzimas redox de membrana, teniendo citocromo bo3 de Escherichia coli como ejemplo. Una combinación de microscopía electroquímica y de fluorescencia se utiliza para controlar el estado redox de las quinona piscina y monitorear cambios en el pH en el lumen. Debido a la resolución espacial de la microscopia fluorescente, cientos de liposomas se pueden medir simultáneamente mientras que el contenido de la enzima puede ser reducido a una sola enzima o transportador por liposomas. El análisis de la respectiva enzima solo puede revelar patrones en la dinámica funcional de enzimas que puede estar ocultos si no por el comportamiento de toda la población. Incluimos una descripción de una secuencia de comandos para el análisis de imagen automatizado.

Introduction

Información sobre mecanismos de enzimas y cinética se obtiene generalmente en el nivel de conjunto o de macroescala con población de enzima en los miles de millones de moléculas, donde las mediciones representan un promedio estadístico. Se sabe, sin embargo, que macromoléculas complejas como las enzimas pueden demostrar heterogeneidad en su comportamiento y mecanismos moleculares observados a nivel de conjunto no son necesariamente válidos para cada molécula. Tales desviaciones en la escala de la molécula individual han sido ampliamente confirmados por estudios de enzimas individuales con una variedad de métodos emergentes durante el último dos décadas1. En particular, detección de la fluorescencia de la actividad enzimática individuales se ha utilizado para investigar la heterogeneidad de la actividad de enzimas2,3 o descubrir el efecto de memoria supuesto (períodos de actividad de las enzimas altas por periodos de baja actividad y viceversa)4,5.

Muchos estudios de la enzima solo requieren que las enzimas son inmovilizadas sobre la superficie o espacial fija de otra manera permanecer suficientemente largo en el campo de visión para la observación continua. Encapsulación de enzima en liposomas se ha demostrado para permitir la inmovilización de la enzima al tiempo que evita cualquier impacto negativo por la superficie enzimas o proteínas interacciones6,7. Además, liposomas ofrecen una posibilidad única para el estudio de proteínas de la membrana solo en sus lípidos naturales bicapa entorno8,9,10.

Una clase de proteínas de membrana, transportadores, ejerce un desplazamiento direccional de sustancias a través de la membrana celular, un comportamiento que sólo puede ser estudiada cuando las proteínas se reconstituyen en el lípido bicapas (por ejemplo, liposomas)11, 12,13. Por ejemplo, translocación de protones, expuesto por varias enzimas de cadenas de transporte del electrón de prokaryotic y eukaryotic, desempeña un papel importante en la respiración celular, mediante la creación de una fuerza protón-motriz utilizada para la síntesis de ATP. En este caso, la actividad de bombeo de protones está acoplado a la transferencia de electrones, aunque el mecanismo detallado de este proceso a menudo sigue siendo elusivo.

Recientemente, hemos demostrado la posibilidad de detección fluorescente par con electroquímica para el estudio de actividad de las enzimas individuales de la oxidasa terminal ubiquinol de Escherichia coli (citocromo bo3) de bombeo de protones reconstituida en liposomas14. Esto se logró mediante la encapsulación de un colorante fluorescente impermeable membrana sensible al pH en el lumen de liposomas preparados a partir de E. coli lípidos polares (figura 1A). La cantidad de proteína fue optimizada para que liposomas mayoría tampoco contienen ninguna o solamente una molécula de enzima reconstituido (según la distribución de Poisson). Los dos sustratos de citocromo bo3 fueron proporcionados mediante la adición de ubiquinona a la mezcla de lípidos que forman los liposomas y el oxígeno (ambiente) en solución. Los liposomas son entonces escasamente fijado por adsorción en un electrodo de oro ultra suave semitransparente, cubierto con una monocapa uno mismo-montado de 6-mercaptohexanol. Finalmente, el electrodo se monta en la parte inferior de una celda electroquímicas simple (figura 1B). Control electroquímico del estado redox quinona piscina permite una flexible activar o detener la reacción enzimática en cualquier momento, mientras que el tinte pH-sensible se utiliza para monitorear cambios en el pH dentro del lumen de los liposomas como resultado de la translocación de protones por el enzimas. Por utilizar que se puede determinar la intensidad de fluorescencia de un colorante fluorescente en segundo lugar, enlazados a lípidos, el tamaño y el volumen de los liposomas y la cuantificación de protones enzima actividad de bombeo. Usando esta técnica, en particular encontramos que citocromo bo3 moléculas son capaces de entrar en un estado de escape espontáneo que rápidamente se disipa la fuerza motriz protónica. El objetivo de este artículo es presentar la técnica de mediciones solo liposomas en detalle.

Protocol

1. preparación de una mezcla de lípidos/UQ-10/FDLL Nota: E. coli lípidos utilizados para la preparación de los liposomas deben ser alícuotas y muy bien mezclada con la ubiquinona-10 (sustrato de la enzima) y onda larga fluorescentes tinte etiquetado lípidos (para determinación del tamaño de liposomas) antes del reconstitución. Utilizando una jeringuilla de cristal, extracto de transferencia 200 μL del stock de cloroformo de lípidos polares de Escheric…

Representative Results

La calidad de la hoja cubierta oro modificado (el electrodo) con un SAM de 6MH se comprueba antes de cada experimento con espectroscopía de impedancia electroquímica. Figura 2A muestra representativas parcelas de Cole-Cole medidas usando la espectroscopia de impedancia electroquímica antes y después de liposomas son adsorbidos. Si la calidad de SAM es suficiente, espectroscopía de impedancia debe demostrar un comportamiento capacitivo casi puro dando por…

Discussion

El método descrito es adecuado para el estudio de las proteínas de la membrana respiratoria que pueden ser reconstituidas en liposomas de bombeo de protones y son capaces de intercambiar electrones con la piscina de la quinona. Actividad de bombeo del protón puede controlarse a nivel individual-enzima con colorantes sensibles al pH (proporcionales) encapsulados en el lumen del liposoma (figura 1A).

El método se basa en la capacidad de ubiquinona (u otras quino…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen la BBSRC (BB/P005454/1) para apoyo financiero. NH fue financiado por el programa de VILLUM Fundación joven investigador.

Materials

6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

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Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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