Summary

Enkele liposoom metingen voor de studie van Proton-pompende membraan enzymen met behulp van de elektrochemie en Fluorescent microscopie

Published: February 21, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3 als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.

Abstract

Proton-pompende enzymen van elektron overbrengen ketens paar redoxreacties op proton translocatie over het membraan, het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor de productie van ATP. De aard van de amfifiele van membraaneiwitten vereist bijzondere aandacht aan hun behandeling en reconstitutie in het natuurlijke lipide-milieu is onontbeerlijk bij de studie van transportprocessen van de membraan zoals proton translocatie. Hier, detail we een methode die is gebruikt voor het onderzoek van het proton-pompende mechanisme van membraan Redoxenzymen, cytochroom bo3 van Escherichia coli als voorbeeld nemen. Een combinatie van elektrochemie en fluorescentie microscopie is gebruikt om de redox staat van de veranderingen van de Chinon zwembad en monitor de pH in het lumen. Als gevolg van de ruimtelijke resolutie van fluorescent microscopie, kunnen honderden liposomen gelijktijdig terwijl de enzym-inhoud kan worden verkleind tot een één enzym of vervoerder per liposoom worden gemeten. De analyse van de respectieve één enzym kan onthullen patronen in de enzym functionele dynamiek die anders zou kunnen worden verborgen met het gedrag van de gehele bevolking. Wij omvatten een beschrijving van een script voor automatische beeldanalyse.

Introduction

Informatie over Enzymmechanismen en kinetiek, wordt meestal opgehaald op het niveau van het ensemble of situering met enzym bevolking in duizenden tot miljoenen van moleculen, waarbij de metingen een statistisch gemiddelde vertegenwoordigen. Het is echter bekend dat complexe macromoleculen zoals enzymen heterogeniteit in hun gedrag aantonen kunnen en moleculaire mechanismen waargenomen op het ensemble-niveau niet noodzakelijkerwijs geldig voor elke molecuul zijn. Dergelijke afwijkingen op de schaal van de individuele molecuul werden uitgebreid bevestigd door studies van enkele enzymen met een verscheidenheid van methoden die zijn ontstaan tijdens de laatste twee decennia1. Met name, is fluorescentie detectie van individuele enzymactiviteit gebruikt voor het onderzoeken van heterogeniteit van2,3 van de activiteit van de enzymen of ontdek het zogenaamde geheugeneffect (periodes van hoge enzymen activiteit opgevolgd door periodes van lage activiteit en vice versa)4,5.

Veel één enzym studies vereisen dat de enzymen worden geïmmobiliseerd op de oppervlakte of ruimtelijk vast op een andere manier te blijven lang genoeg in het gezichtsveld voor de continue waarneming. Enzym inkapseling in liposomen is aangetoond dat het enzym immobilisatie terwijl het voorkomen van eventuele negatieve gevolgen vanwege de oppervlak-enzym of eiwit-eiwit interacties6,7inschakelen. Daarnaast, bieden liposomen een unieke mogelijkheid om te studeren één membraaneiwitten in hun natuurlijke lipide dubbelgelaagde milieu8,9,10.

Een klasse van membraaneiwitten, vervoerders, oefent een directionele translocatie van stoffen tussen de celmembranen, een probleem dat alleen kan worden bestudeerd wanneer eiwitten worden aangemaakt in de lipide bilayers (b.v., liposomen)11, 12,,13. Bijvoorbeeld, speelt proton translocatie, tentoongesteld door verschillende enzymen van prokaryote en eukaryote electron vervoersketens, een belangrijke rol in de cellulaire ademhaling door het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor ATP-synthese. In dit geval is het proton pompen van de activiteit gekoppeld aan de overdracht van het elektron, hoewel de gedetailleerde mechanisme van dit proces vaak ongrijpbaar blijft.

Onlangs, we de mogelijkheid om paar TL detectie met elektrochemie te bestuderen van proton pompen activiteit van enkele enzymen van de terminal ubiquinol oxidase van Escherichia coli (cytochroom bo3) aangetoond gereconstitueerd in de liposomen14. Dit werd bereikt door de inkapseling van een pH-gevoelige membraan-ondoordringbare fluorescente kleurstof in het lumen van de liposomen bereid uit E. coli polar lipiden (figuur 1A). Het bedrag van de eiwitten is geoptimaliseerd zodat de meeste liposomen ofwel geen of slechts één gereconstitueerde enzym molecuul (volgens de Poisson-verdeling bevatte). De twee substraten voor cytochroom bo3 werden verstrekt door ubiquinone toe te voegen aan de mix van lipide dat de liposomen en (omgevingstemperatuur) zuurstof gevormd in oplossing. De liposomen zijn dan dun geadsorbeerde op een semi-transparante ultrasoepel gouden elektrode, bedekt met een zelf samengestelde enkelgelaagde van 6-mercaptohexanol. Tot slot, de elektrode is gemonteerd op de onderkant van de cel van een eenvoudige spectroelectrochemical (figuur 1B). Elektrochemische controle van de Chinon zwembad redox staat maakt het mogelijk een flexibel starten of stoppen van de enzymatische reactie op elk moment, terwijl de pH-gevoelige kleurstof gebruikt voor het bewaken van pH veranderingen binnen het lumen van de liposomen als gevolg van proton translocatie door de enzymen. Met behulp van die de intensiteit van de fluorescentie van een tweede, lipide-gebonden fluorescente kleurstof, de grootte en het volume van de afzonderlijke liposomen kan worden bepaald en dus de kwantificering van enzym proton pompen activiteit. Met behulp van deze techniek, vonden met name wij dat cytochroom bo3 moleculen om te gaan met een spontane lek staat die snel de proton motive force verdwijnt. Het doel van dit artikel is voor het omschakelen techniek van één liposoom metingen in detail.

Protocol

1. bereiding van de Mix van een lipide/UQ-10/FDLL Opmerking: E. coli lipiden gebruikt voor de voorbereiding van de liposomen moeten worden aliquoted en grondig gemengd met ubiquinone-10 (enzym substraat) en lange golflengte fluorescerende kleurstof-geëtiketteerden lipiden (voor de bepaling van de maat van de liposomen) voorafgaand aan de reconstitutie. Met een glazen injectiespuit, overdracht 200 µL van chloroform voorraad van lipide polar uittreksel van Esche…

Representative Results

De kwaliteit van de goud-bewerkt cover slip (de elektrode) met een SAM van 6MH wordt gecontroleerd voordat elk experiment met elektrochemische impedantie spectroscopie. Figuur 2A toont representatieve Cole-Cole percelen gemeten met behulp van elektrochemische impedantie spectroscopie voordat en nadat de liposomen zijn geadsorbeerd. Als de kwaliteit van SAM voldoende is, kan een bijna pure capacitieve gedrag wat resulteert in een semi-cirkel Cole-Cole plot moe…

Discussion

De beschreven methode is geschikt om te studeren van proton pompen door respiratoire membraaneiwitten die kunnen worden toegevoegd in liposomen en kunnen uitwisselen van elektronen met de Chinon zwembad. Proton pompen activiteit kan worden gecontroleerd op het niveau van de single-enzym met pH-gevoelige (ratiometric) verfstoffen ingekapseld in het liposoom lumen (figuur 1A).

De methode is afhankelijk van het vermogen van ubiquinone (of andere quinones), opgenomen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen het BBSRC (BB/P005454/1) voor financiële steun. NH werd gefinancierd door de VILLUM Foundation Young Investigator programma.

Materials

6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

References

  1. Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
  2. Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
  3. Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
  4. Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. . Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).
  5. Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work?. Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
  6. Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
  7. Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
  8. García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
  9. Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
  10. Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
  11. Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA – Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
  12. Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
  13. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  14. Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
  15. Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
  16. Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
  17. Barsoukov, E., Macdonald, J. R. . Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).
  18. Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
  19. Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , (2018).
  20. Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).
  21. Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. . Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
  22. Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
  23. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
  24. Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
  25. Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
  26. Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
  27. Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
  28. Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
  29. Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).

Play Video

Cite This Article
Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

View Video