Hier presenteren we een protocol om te bestuderen van het moleculaire mechanisme van proton translocatie in verschillende lipide membranen van één liposomen, met behulp van cytochroom bo3 als voorbeeld. Het combineren van de elektrochemie en fluorescentie microscopie, pH-veranderingen in het lumen van enkele blaasjes, bevattende één of meerdere enzym, kan worden gedetecteerd en individueel geanalyseerd.
Proton-pompende enzymen van elektron overbrengen ketens paar redoxreacties op proton translocatie over het membraan, het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor de productie van ATP. De aard van de amfifiele van membraaneiwitten vereist bijzondere aandacht aan hun behandeling en reconstitutie in het natuurlijke lipide-milieu is onontbeerlijk bij de studie van transportprocessen van de membraan zoals proton translocatie. Hier, detail we een methode die is gebruikt voor het onderzoek van het proton-pompende mechanisme van membraan Redoxenzymen, cytochroom bo3 van Escherichia coli als voorbeeld nemen. Een combinatie van elektrochemie en fluorescentie microscopie is gebruikt om de redox staat van de veranderingen van de Chinon zwembad en monitor de pH in het lumen. Als gevolg van de ruimtelijke resolutie van fluorescent microscopie, kunnen honderden liposomen gelijktijdig terwijl de enzym-inhoud kan worden verkleind tot een één enzym of vervoerder per liposoom worden gemeten. De analyse van de respectieve één enzym kan onthullen patronen in de enzym functionele dynamiek die anders zou kunnen worden verborgen met het gedrag van de gehele bevolking. Wij omvatten een beschrijving van een script voor automatische beeldanalyse.
Informatie over Enzymmechanismen en kinetiek, wordt meestal opgehaald op het niveau van het ensemble of situering met enzym bevolking in duizenden tot miljoenen van moleculen, waarbij de metingen een statistisch gemiddelde vertegenwoordigen. Het is echter bekend dat complexe macromoleculen zoals enzymen heterogeniteit in hun gedrag aantonen kunnen en moleculaire mechanismen waargenomen op het ensemble-niveau niet noodzakelijkerwijs geldig voor elke molecuul zijn. Dergelijke afwijkingen op de schaal van de individuele molecuul werden uitgebreid bevestigd door studies van enkele enzymen met een verscheidenheid van methoden die zijn ontstaan tijdens de laatste twee decennia1. Met name, is fluorescentie detectie van individuele enzymactiviteit gebruikt voor het onderzoeken van heterogeniteit van2,3 van de activiteit van de enzymen of ontdek het zogenaamde geheugeneffect (periodes van hoge enzymen activiteit opgevolgd door periodes van lage activiteit en vice versa)4,5.
Veel één enzym studies vereisen dat de enzymen worden geïmmobiliseerd op de oppervlakte of ruimtelijk vast op een andere manier te blijven lang genoeg in het gezichtsveld voor de continue waarneming. Enzym inkapseling in liposomen is aangetoond dat het enzym immobilisatie terwijl het voorkomen van eventuele negatieve gevolgen vanwege de oppervlak-enzym of eiwit-eiwit interacties6,7inschakelen. Daarnaast, bieden liposomen een unieke mogelijkheid om te studeren één membraaneiwitten in hun natuurlijke lipide dubbelgelaagde milieu8,9,10.
Een klasse van membraaneiwitten, vervoerders, oefent een directionele translocatie van stoffen tussen de celmembranen, een probleem dat alleen kan worden bestudeerd wanneer eiwitten worden aangemaakt in de lipide bilayers (b.v., liposomen)11, 12,,13. Bijvoorbeeld, speelt proton translocatie, tentoongesteld door verschillende enzymen van prokaryote en eukaryote electron vervoersketens, een belangrijke rol in de cellulaire ademhaling door het creëren van een proton-stuwende kracht gebruikt voor ATP-synthese. In dit geval is het proton pompen van de activiteit gekoppeld aan de overdracht van het elektron, hoewel de gedetailleerde mechanisme van dit proces vaak ongrijpbaar blijft.
Onlangs, we de mogelijkheid om paar TL detectie met elektrochemie te bestuderen van proton pompen activiteit van enkele enzymen van de terminal ubiquinol oxidase van Escherichia coli (cytochroom bo3) aangetoond gereconstitueerd in de liposomen14. Dit werd bereikt door de inkapseling van een pH-gevoelige membraan-ondoordringbare fluorescente kleurstof in het lumen van de liposomen bereid uit E. coli polar lipiden (figuur 1A). Het bedrag van de eiwitten is geoptimaliseerd zodat de meeste liposomen ofwel geen of slechts één gereconstitueerde enzym molecuul (volgens de Poisson-verdeling bevatte). De twee substraten voor cytochroom bo3 werden verstrekt door ubiquinone toe te voegen aan de mix van lipide dat de liposomen en (omgevingstemperatuur) zuurstof gevormd in oplossing. De liposomen zijn dan dun geadsorbeerde op een semi-transparante ultrasoepel gouden elektrode, bedekt met een zelf samengestelde enkelgelaagde van 6-mercaptohexanol. Tot slot, de elektrode is gemonteerd op de onderkant van de cel van een eenvoudige spectroelectrochemical (figuur 1B). Elektrochemische controle van de Chinon zwembad redox staat maakt het mogelijk een flexibel starten of stoppen van de enzymatische reactie op elk moment, terwijl de pH-gevoelige kleurstof gebruikt voor het bewaken van pH veranderingen binnen het lumen van de liposomen als gevolg van proton translocatie door de enzymen. Met behulp van die de intensiteit van de fluorescentie van een tweede, lipide-gebonden fluorescente kleurstof, de grootte en het volume van de afzonderlijke liposomen kan worden bepaald en dus de kwantificering van enzym proton pompen activiteit. Met behulp van deze techniek, vonden met name wij dat cytochroom bo3 moleculen om te gaan met een spontane lek staat die snel de proton motive force verdwijnt. Het doel van dit artikel is voor het omschakelen techniek van één liposoom metingen in detail.
De beschreven methode is geschikt om te studeren van proton pompen door respiratoire membraaneiwitten die kunnen worden toegevoegd in liposomen en kunnen uitwisselen van elektronen met de Chinon zwembad. Proton pompen activiteit kan worden gecontroleerd op het niveau van de single-enzym met pH-gevoelige (ratiometric) verfstoffen ingekapseld in het liposoom lumen (figuur 1A).
De methode is afhankelijk van het vermogen van ubiquinone (of andere quinones), opgenomen …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen het BBSRC (BB/P005454/1) voor financiële steun. NH werd gefinancierd door de VILLUM Foundation Young Investigator programma.
6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
Auxiliary electrode | platinum wire | ||
Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
Gold | GoodFellow | 99.99% | |
Gramacidin | Sigma | G5002 | |
Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |