분해 활동에 대 한 화면에 Fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과: 코로나 바이러스에 대 한 응용 프로그램 스파이크 단백질 활성화

선물이 여기 fluorogenic 펩 티 드 분석 결과 프로 테아 제에 의해 그들의 분해 분열에 대 한 단백질 시퀀스의 빠른 심사에 대 한 수 있습니다. 우리의 첫 번째 예제에서 우리는 다른 분열이 분석이 결과 대 한 응용 프로그램을 설명 하기 위해 메 CoV 스파이크 (S) 단백질의 사이트 주제를 선택 했다. 몇몇 바이러스 나 퓨전 메 CoV, SARS CoV (중증 급성 호흡기 증후군), 인플루엔자 등 단백질은 공중 보건에 대 한 중요 한 관심사 및 새로운 하위는 끊임없이 진화 하는 그는 교차 하는 종 가능성이 클래스는 둘러싸 인간^1,,1516에 그들의 자연적인 호스트에서 장벽. 바이러스를 분리 하 고 실험실에서 배양 항상 가능한 않을 수 있습니다 또는 모든 연구 시설에서 제공 되지 않는 특별 한 실험실을 요구 한다. 따라서, 일반 실험실 조건 하에서 실시 될 수 있는 새로운 바이러스의 잠재적인 공중 보건 위협 평가 하는 방법에 대 한 필요가 있다. 인간을 대상으로 하는 바이러스 뿐만 아니라 FCoV 같은 일부 동물 바이러스 또한 소유 같은 종류 I 융해 단백질, 그러므로, 그들의 인간 대조 물 보다는 유사한 특성을 공유. 이러한 바이러스를 격리 그들을 공부 하는 혁신적인 도구를 사용 하 여 필요한 만들기 도전 될 수 있습니다.

위에서 언급 한 바이러스의 수명 주기에서 중요 한 단계는 호스트 셀 항목 및 퓨전 호스트 프로 테아 제^1,2로 각각 융해 단백질의 분해 처리 하 여 중재입니다. 바이러스 성 수명 주기의이 부분을 조사 하는 표준 방법 이다 포유류 식 벡터에 융합 단백질 유전자를 복제, 포유류 세포 단백질 발현에 대 한 허용, 품 어 또는 공동 관심, 격리의 효소와 transfect transfect는 단백질 및 서쪽 오 점 분석을 수행. 이 방법은 몇 가지 제한 사항이 제공: 복제, DNA 또는 RNA, 사용할 수 있는 경우는 유전자를 합성에 대 한 비용에 대 한 바이러스 성 DNA/RNA의 융해 단백질의 분열 제품, 그리고 그것을 검출 하는 항 체의 최대 걸릴 수 있습니다 몇 가지 주 전체 연구 수행 될 때 까지입니다. 그것은 심지어 더 많은 시간이 걸리는, 돈과 노동 경우 사이트 지시 된 mutagenesis 필요 하기 때문에 분열 사이트에 몇 가지 돌연변이 조사 하는 연구의 관심은 집중 된다. 여기 설명 fluorogenic 펩 티 드 분석 결과 이러한 한계는 없습니다. 펩 티 드의 공개적으로 사용 가능한 시퀀스에 따라 디자인 될 수 있다, 다양 한 연구의 이러한 종류에 대 한 관련 된 재조합 프로 테아 제를 제공 하는 여러 공급 업체와 분석 등 분석 결과 내에서 수행할 수 있는 단일 하루입니다.

우리의 예제에서 우리는 s 2의 furin 중재 분열 검사 ‘ 메 CoV S 단백질의 효소 인식 사이트 인간과 이집트와 모로코에서 낙 타에서 파생 된. 낙 타와 인간의 EMC/2012 HKU205 S2’ 일반적인 RXXR furin 분열 모티브를 포함 하는 사이트. 그러나, 점수 알고리즘 HKU205 S2 PiTou 2.0 쪼개 짐에 따라 ‘ 사이트 하지 우리는 furin에 의해 실험적으로 확인 된¹⁹죽 습 될 전망 이다. 이유 왜 HKU5 S2’에 의해 처리 되지 않습니다 furin 때문일 수는 P1에 이소류신 ‘ 위치. 우리는 EMC/2012 S2에 개별 돌연변이 전달 하는 2 개의 펩 티 드를 시험 하는 때 ‘ 순서, 우리 확인 수 있었다는 P1에 이소류신 ‘ 감소 분열 귀착되 었 다 떠들고 대체에 알라닌 반면 크게 분열 되어있는. Mor213 S2’ 사이트 furin 분열 모티브를 포함 하지 않습니다 그리고 그것은 거의 아무 분열을 감지 하는 놀라운 일이 아니었다. 우리는 또한 어떻게 furin 앞 S1/S2 및 S2 시험 ‘ FCoV S 단백질의 효소 인식 사이트. 우리 모두 FECV 펩 티 드의 furin 분열을 관찰할 수 있었다 (FECV I와-4 S1/S2 및 FECV II 1683 S2’), FIPV 바이러스에서 돌연변이 순서 furin에 의해 죽 습 하지 했다.

EMC/2012 s 2의 furin 중재 분열을 비교할 때 ‘ 펩 티 드 (그림 1A) FECV I와-4 S1/2 펩 티 드 (그림 2A)와 함께, 우리는 브이 맥스에서 대략 26-fold 차이 발견. 이 두 시퀀스 (표 1)에서 furin 분열 모티브에 의해 설명 될 수 있다. Furin 분열에 대 한 최소 요구는 RXXR 모티브, RXRR 순서는 훨씬 더 유리한²입니다. 따라서, EMC/2012 S2′ 펩 티 드, RSAR 모티브가 RSRR furin 분열 사이트 (표 1)를 포함 하는 FECV I와-4 S1/2 펩 티 드에 비해 더 적은으로 죽 습.

그러나, 분석 결과의 한 가지 주요 한계는 펩 티 드에는 그들은 일반적으로에 포함 된 단백질의 3 차 구조를 반영 하지 않습니다. 전체 길이 융해 단백질의 분열 융해 펩 티 드를 제공 하 고 트리거 호스트 셀 항목¹. 우리는 펩 티 드 더 많거나 적은 선형 가정 하는 동안 융해 단백질의 3 차 구조에 의해 효소와 퓨전 단백질 사이 상호 작용 또한 영향을 수도 있습니다. 따라서, 분열 펩 티 드 분석 결과에서 발견 인공 수 있으며 vivo에서 상황을 반영 하지 않을 수 있습니다. 이 인플루엔자 H3N2 하 하위의 분열에 대 한 matriptase에 의해 보고 되었다. 여러 그룹의 H3N2 하 분열 펩 티 드 분석 실험에서 matriptase 설명, 하는 동안 그것은 또한 fusogenic HA 단백질^{4,20, 전체 길이 H3N2 하 단백질 및 세포 배양에서 matriptase의 부 화 발생 하지 않았다 표시 했다 21}. 분해 분열의 생물학으로 중요 한 규정의 단백질 구조 수준에는 보여 주는 다른 예제 들이 있다.입니다. 그것은 퓨전 단백질 때때로 일련의 융합에 따라 분열 사이트 노출 수를 미리 퓨전 이벤트 필요 설명 하고있다. Semliki 숲 바이러스 융해 단백질, 예를 들어 prefusion 이벤트의 융해 단백질을 노출 하 고 분해 활성화²²사용할 수 중 구조 재배열을 요구 한다. 따라서, fluorogenic 펩 티 드 분석 결과에서 얻은 결과 셀 퓨전 분석 실험 또는 유사한 실험에 의해 확인 될 필요가 있다. 그러나, 펩 티 드 분석 결과 아직도 여러 효소/펩 티 드 조합 및 분열을 표시 하지 않는 조합은 매우 가능성이 같은 결과는 vivo에서전시 이후 노동 및 후속 실험의 시간을 줄이기 위해 빠른 심사를 허용 한다.

분석 결과의 두 번째 주요 한계는 프로 테아 제를 염려 한다. 지금까지 그것은 수용 성 프로 테아 제 하지만 하지 막 횡단 프로 테아 제를 테스트 수 있습니다. 실험의 의도 따라이 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어, 인플루엔자는 다양 한 세포 막⁸에 위치한 막 횡단 프로 테아 제에 의해 활성화 됩니다. 어느 정도 녹는 분해 활성 도메인을 사용 하 여이 문제를 피할 수 있지만 결과 주의로 해석 하 고 기존의 방법으로 확인 합니다. Matriptase 그리고 그것의 활동으로 H3N2 하 beforementioned 예제를 참조 합니다. Vivo에서 matriptase은 세포 막에 있지만 상업적으로 이용 가능한 효소는 수용 성 촉매 도메인. 융합 단백질에 관하여 설명 했 듯이, 그것은 가능한 그것은 또한 절단과 테스트 단일 도메인만 초래할 수 있다는 오판을 전장 단백질 기질 상호 작용 길이 효소 필요 합니다 수 있습니다.

이 방법론은 furin에 의해 특정 아미노산 시퀀스의 분열을 공부 효율적으로 보이고 있다. 그러나, 기술은 범위의 모든 사용 가능한 프로 테아 제 (예, cathepsins, proprotein convertase), 응용 프로그램 화면 펩타이드 후보 효소 분열에 대 한 유용한 방법을 만들고. 또한, 그것은 보였다이 분석 결과 또한 protease 억제제의 효능을 테스트 하는 데 사용 수 및 따라서 빨리 하 고 쉽게 화면 단백질 억제제²³도구를 제공 합니다.

여기에 설명 된 fluorogenic 펩 티 드 분열 분석 결과 아미노산 속성 및 순서에 따라 결정 된 효소에 의해 펩 티 드 분열 예측 알고리즘, 득점 bioinformatic 분열에 추가 나타냅니다. 이 두 기술은 함께 전통 서양 기술을 blotting 효소 분열 시험관을 공부 하는 효율적인 방법으로 사용할 수 있습니다.