Ein Fluorogenic Peptid Spaltung Assay zum Bildschirm für die proteolytische Aktivität: Anwendungen für Coronavirus spike Protein-Aktivierung
Summary
Wir präsentieren einen Fluorogenic Peptid Spaltung-Assay, der eine schnelle Screening der proteolytischen Aktivität der Proteasen auf Peptide repräsentieren die Spaltstelle virale Fusion Peptide ermöglicht. Diese Methode kann auch auf andere Aminosäure-Motiv in eine Proteinsequenz verwendet werden, für die Protease-Aktivität zu testen.
Abstract
Behüllte Viren wie z. B. Coronaviren oder Influenza Virus erfordern proteolytische Spaltung von ihrer Schmelzverfahren Protein zu die Wirtszelle infizieren können. Oft Viren aufweisen Zell- und Tropismus und bestimmten Zelle oder eines Gewebes Proteasen angepasst sind. Darüber hinaus können diese Viren Mutationen oder Einfügungen in ihr Genom während der Replikation einzuführen, die beeinträchtigen die Spaltung, und somit können zur Anpassung an einen neuen Host. Hier präsentieren wir Ihnen einen Fluorogenic Peptid Spaltung Assay, der eine schnelle Screening von Peptiden imitiert die Spaltstelle von viralen Fusionsproteine ermöglicht. Die Technik ist sehr flexibel und kann verwendet werden, um die proteolytische Aktivität der einzelnen Protease auf vielen verschiedenen Untergründen zu untersuchen, und darüber hinaus ermöglicht es auch Exploration der Aktivität von mehreren Proteasen auf einem oder mehreren Peptid-Substraten. In dieser Studie verwendeten wir Peptide imitiert die Spaltung Website Motive des Coronavirus Spike-Proteins. Wir testeten menschlichen und Kamel abgeleitet Nahen Osten respiratorisches Syndrom Coronaviren (MERS-CoV) zeigen, dass ein- und Auswechslungen in der Spaltstelle die Aktivität der Furin verändern und Spaltung Effizienz drastisch ändern können. Wir nutzten diese Methode in Kombination mit Bioinformatik, Furin Spaltung Aktivität der feline Coronavirus Spike Proteine aus verschiedenen Serotypen und Stämme zu testen. Dieses Peptid-basierte Methode ist weniger Arbeits- und zeitintensiv als herkömmliche Methoden für die Analyse der proteolytischen Aktivität auf Viren, und Ergebnisse können innerhalb eines einzigen Tages.
Introduction
Virale Fusion mit der Host-Zellmembran ist ein entscheidender Schritt im Lebenszyklus von behüllten Viren und erleichtert die Aufnahme in die Zelle und die Replikation des Virus. In der Regel besitzen Viren eine spezielle Protein (oder Proteine), die an Rezeptoren auf der Zellmembran Host bindet und löst die Virus-Zelle Membrane Fusion1. Viralen Fusionsproteine wurden in drei Hauptklassen (I-III)1gruppiert. Eine Reihe von Viren, die derzeit ein wichtiges Anliegen für die öffentliche Gesundheit, wie z. B. Influenza-Virus (für eine langjährige zoonotische Entstehung von Vögel) und Nahen Osten respiratorische Syndrom-Coronavirus (MERS-CoV) sind (repräsentieren eine neue Zoonose Entstehung von Kamelen), nutzen die sogenannte Klasse I Fusionsproteine, die proteolytische Verarbeitung von Host Proteasen, ausüben, ihre Fusogenic Aktivität2erfordern. In ähnlicher Weise feline Coronavirus (FCoV), die eine schwere Erkrankung Bedrohung für Wild- und Katzen darstellt, verfügen auch über eine Klasse ich Fusionsproteins. Klasse I virale Fusion Proteine sind in der Regel als ein uncleaved Vorläufer synthetisiert und in der Regel bestehen aus zwei Domänen, die für Rezeptor binden und das Fusion-Ereignis auslöst bzw. verantwortlich sind. Bis heute ist die Influenza Hämagglutinin (HA) die am besten verstanden Schmelzverfahren Protein und zahlreiche Studien haben seine mechanistische Rolle Host Zelle Eintritt und Fusion3beschrieben. In diesem Fall tritt Spaltung des Fusionsproteins in einer bestimmten Reihenfolge oder Spaltstelle in HA und in Kombination mit pH-abhängigen Konformationsänderungen, Ergebnisse in der Ausstellung des viralen Fusion Peptid1,2.
Das Fusion-Peptid und seine vorhergehenden Protease Erkennungssequenz sind entscheidend für die Pathogenität und der Host-Anpassung des Virus. Änderungen in der Protease Erkennungssequenz können Spaltung mit möglicherweise dramatischen Folgen für das Virus und die Host-4erheblich verändern. Auf der einen Seite kann es Spaltung aufzuheben und so den Lebenszyklus des Virus beseitigen. Aber auf der anderen Seite eine Mutation kann die Substratspezifität für einen bestimmten Protease zu erhöhen und/oder ermöglichen eine “neue” Protease, die Schmelzverfahren Protein zu Spalten. Danach können auch die Zell- und Tropismus wie beobachtet, z. B. mit Influenza-Virus-Subtypen5,6erweitern. In der Regel niedrige Pathogenität Influenzaviren (LPAI) und die meisten menschliche Influenza-Viren sind beschränkt auf die Atemwege oder Magen-Darm-Trakt aufgrund der begrenzten Lokalisierung von Proteasen, die sie aktivieren. In der Regel ist das Fusion-Peptid solcher HA Proteine eine vier-amino Acid Sequenz, die besteht aus 1-2 nichtkonsekutiver basischen Aminosäuren, voraus, die von Trypsin-ähnlichen Serin Proteasen wie Trypsin, Matriptase oder TMPRSS27, erkannt wird 8. wenn das Virus erwirbt Insertionen oder Mutationen, die die Spaltstelle auf eine polybasic Website zu ändern, es ermöglicht Furin, HA zu aktivieren und zu führen, eine viel mehr schwere systemische Infektion6,9. Diese Viren werden als hohe Pathogenität Vogelgrippe-Virus (HPAI), beispielsweise im Zusammenhang mit H5N1-Stämme bezeichnet.
Im Gegensatz zur Grippe HA haben viele Coronaviren wie MERS-CoV, zwei unterschiedliche Spaltstellen innerhalb ihrer Spike-Proteins. S1/S2-Website der C-terminalen Fusion Domäne (S2), trennt die N-terminale Rezeptor bindende Domäne (S1) mit einer zweiten Spaltstelle, genannt S2 “, unterhalb des Standortes S1/S2, in der Nähe der Fusion-Peptid-10. Es wurde vorgeschlagen, dass die Seiten nacheinander, bei S1/S2 gefolgt von S2 gespalten sind “. Im Gegensatz zu den HA von den meisten Influenza-Virus-Stämme, die MERS-CoV S-Protein S1/S2 und S2′ Websites durch Proteasen der proprotein Konvertase (PC)-Familie, wie Furin erkannt werden. Mitglieder dieser Familie cleave bei gekoppelten grundlegende Rückstände mit dem Motiv R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. Im Allgemeinen werden die Aminosäuren stromaufwärts der Spaltstelle bezeichnet als P1, P2, P3. beginnend mit der Spaltstelle und flussabwärts der Aminosäuren werden als P1 bezeichnet “, P2′, P3”, etc.. 11. FCoV-Stämme besitzen entweder ein einzelnes oder eine dual Spaltstelle. Wie MERS-CoV, einige Stämme FCoV besitzen auch zwei Spaltstellen (S1/S2 und S2 “) in ihren S-Protein. Allerdings ist dieses Merkmal exklusive Serotyp I FCoVs (Stamm A). Im Gegensatz dazu haben Mitglieder der Vereinigung Serotyp II (Clade B) nur einen einzigen Spaltstelle (S2 “)2,12. Mehreren Proteasen sind vorgeschlagen worden, um die FCoV Spaltstellen, einschließlich Furin, Trypsin-ähnlichen Proteasen und Cathepsin Spalten. Es wurde vorgeschlagen, dass das S-Protein des enterischen FCoV (auch bekannt als feline enterale Coronavirus oder FECV) Furin im Ortsbild S1/S2 und Mutationen in diesem Aufstellungsort gespalten werden dürfte (wie auch bei S2 “) führt zu Änderungen der Protease-Anforderungen. Diese Mutationen wurden Änderungen in den Tropismus und Pathogenität dieser Viren, so dass der Virus zu systemischen und Makrophagen-Wendekreis (auch bekannt als feline infektiöse Peritonitis-Virus oder FIPV)13zugeordnet.
Viren stellen natürlich Mutationen in ihre Genome während jedem Replikationszyklus und häufig neue Subtypen und Grippeviren, MERS-CoV und FCoV sind beschrieben14,15,16. Als Teil eine rasche Auswertung der Bedrohung der öffentlichen Gesundheit von neuen Viren zu beurteilen ist es wichtig, Veränderungen in der Spaltstelle und wie wirkt sich das Spektrum der Proteasen aktivieren diese Viren zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine Peptid-basierte Test, das ermöglicht eine sehr schnelle Beurteilung der Auswirkungen der Spaltung Website Änderungen in MERS-CoV S-Protein die Substratspezifität von einem bestimmten Protease und verschiedenen Proteasen für ihre Fähigkeit, Spalten schnell auf den Bildschirm eines gegebenen oder mehrere Sequenzen4. In einer zweiten Reihe von Experimenten verwendet wir die Technik die Furin Spaltung Aktivität über verschiedene FCoV-Serotypen und Stämme zu bestimmen.
Die Peptide, die in diesem Test verwendet werden mit dem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) paar, 7-Methoxycoumarin-4-Yl Acetyl (MCA) am N-Terminus und N-2,4-Dinitrophenyl (DNP) am C-Terminus geändert. Während der Test MCA ist aufgeregt und emittiert Licht-Energie, die von DNP gestillt ist, solange das Paar in unmittelbarer Nähe zueinander ist. Tritt Spaltung jedoch DNP ist nicht in der Lage, die Emission nicht mehr zu stillen und es kann von der Fluoreszenz-Platte-Reader gelesen werden. Die Veränderungen in der Fluoreszenz wird gemessen, während das Experiment zur Bestimmung der Peptid Spaltung und zur Berechnung der Geschwindigkeit, bei der die Protease die spezifischen Peptid (auch bekannt als Vmax)17 spaltet.
Um die Peptide zu entwerfen, muss das gen des jeweiligen Fusionsproteins wurden sequenziert und/oder in einer Datenbank zur Verfügung gestellt. Die Methode ist jedoch weniger Arbeit intensiv und kostspieliger als herkömmliche Methoden, die in der Regel das Klonen des Fusion-Gens in Expressionsvektoren in Säugetierzellen erfordern zu analysieren, die Spaltung zu fassen. Von Anfang bis Ende kann dies mehrere Tage bis wenige Wochen dauern, während die hier präsentierten Peptid-Assays, innerhalb eines Tages erfolgen können als Peptide und Proteasen zur Verfügung stehen. Die Einrichtung des Tests dauert zwischen 5 und 30 min, je nach der Anzahl der Stichproben und die Laufzeit in der Fluoreszenz-Platte-Leser ist, 1 h. Analyse der Daten kann dauern, bis zu 2 h wieder abhängig von der Größe der Stichprobe.
Hier haben wir zwei unterschiedliche Beispiele auf die Probe zu stellen. Im ersten Beispiel präsentieren wir Daten, die die Furin-vermittelte Spaltung der menschlichen und Kamel-abgeleitete MERS-CoV, bewerten das Potenzial der Kamel-abgeleitete Stämme der Menschen aktiviert wird, wenn sie die Artengrenze übereinander vergleicht. Im zweiten Beispiel wir zum einen Fluorogenic Peptid-Assay Furin-vermittelte Spaltung der S1/S2 und S2 bestimmen “Websites oder S2′ Sitz von zwei Serotyp ich und zwei Serotyp II FCoV Stämme, beziehungsweise. Für diese Experimente haben wir Trypsin Spaltung als Positivkontrolle verwendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir stellen Ihnen hier einen Fluorogenic Peptid-Assay, der eine schnelle Screening von Proteinsequenzen für ihre proteolytische Spaltung durch Proteasen ermöglicht. In unserem ersten Beispiel wählten wir verschiedene Spaltung Website Motive des MERS-CoV Spike (S) Proteins eine Anwendung für diese Probe veranschaulichen. Einige umhüllte Viren, die besitzen Klasse habe ich Fusion Proteine wie MERS-CoV, SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome) und Grippe sind Hauptanliegen für die öffentliche Gesundheit und neue Subtypen sind ständig in Bewegung, die ein Potenzial zur Spezies zu überqueren Barrieren aus ihrer natürlichen Wirte Menschen1,15,16. Die Viren zu isolieren und kultivieren sie im Labor möglicherweise nicht immer machbar oder erfordert spezielle Labors, die nicht in jede Forschungseinrichtung zur Verfügung stehen. Daher gibt es einen Bedarf an Methoden, um die potenzielle Bedrohung der öffentlichen Gesundheit von neuen Viren zu ermitteln, die unter normalen Laborbedingungen durchgeführt werden können. Neben Viren gezielt Menschen, einige tierische Viren wie FCoV auch besitzen die gleiche Klasse I Fusionsproteine, daher, der ähnlichen Eigenschaften als ihre menschlichen Kollegen zu teilen. Diese Viren zu isolieren, kann auch eine Herausforderung, die Nutzung innovativer Werkzeuge, sie zu studieren notwendig sein.
Ein entscheidender Schritt im Lebenszyklus des oben genannten Viren ist Host Zelleintrag und Fusion vermittelt durch proteolytische Verarbeitung des jeweiligen Fusionsproteins Host Proteasen1,2. Eine Standardmethode für diesen Teil des viralen Lebenszyklus untersuchen soll Klonen die Fusionsgen Protein in Säugetieren Expressionsvektor, transfizieren Säugerzellen, die Proteinexpression ermöglichen, brüten oder Co transfizieren mit Protease von Interesse, isolieren die Protein und ein western-Blot-Analysen durchführen. Diese Methode kommt mit mehreren Einschränkungen: Verfügbarkeit der viralen DNA/RNA für das Klonen, Kosten für die Synthese des Gens, wenn keine DNA oder RNA vorliegt, Verfügbarkeit eines Antikörpers zur Erkennung von Fusionsproteins und seiner Spaltung Produkt (e) und es kann dauern, bis zu mehreren Wochen, bis die gesamte Studie durchgeführt wird. Es wird sogar mehr zeitaufwendig, Geld und arbeitsintensiv, wenn das Interesse der Studie ist es, mehrere Mutationen in der Spaltstelle untersuchen, denn dazu ist die Site-verwiesene Mutagenese. Der Fluorogenic-Peptid-Test, die, den wir hier beschreiben, muss diese Einschränkungen nicht. Die Peptide von Interesse basiert auf öffentlich zugänglichen Sequenzen gestaltet werden können, gibt es mehrere Anbieter, die eine Vielzahl von rekombinanten Proteasen bereitstellen, die für diese Art von Studien relevant sind und der Assay, einschließlich der Analyse durchgeführt werden kann, innerhalb einer einzigen Tag.
In unserem Beispiel untersuchten wir Furin-vermittelte Spaltung des S2 “Protease Anerkennung Website des MERS-CoV S Proteins abgeleitet von Menschen und Kamelen aus Ägypten und Marokko. Die menschlichen EMC/2012 und das Kamel HKU205 S2′-Seiten enthalten auch ein typisches RXXR Furin Spaltung Motiv. Jedoch nach der PiTou 2.0 Spaltung scoring-Algorithmus der HKU205 S2′ Website voraussichtlich nicht durch Furin, welche wir experimentell bestätigten19gespalten werden. Der Grund warum HKU5 S2 “wird nicht durch verarbeitet Furin möglicherweise aufgrund der Isoleucin in der P1” Position. Wenn wir testeten zwei Peptide, die die einzelnen Mutationen in der EMC/2012 S2 durchgeführt “Sequenz, konnten wir bestätigen, dass die Isoleucin in der P1” weitgehend hebt Spaltung, Alanin, Serin Substitution reduzierte Spaltung geführt. Die Mor213 S2′ Website enthält keine Furin Spaltung Motiv und es war nicht überraschend, fast keine Spaltung zu erkennen. Wir auch untersucht, wie Furin S1/S2 und S2 spaltet “Protease Anerkennung Stätten der FCoV S-Protein. Wir konnten beobachten Furin Spaltung der beiden FECV Peptide (FECV I und 4 S1/S2 und FECV II 1683 S2 “), während mutierte Sequenzen von FIPV Viren nicht durch Furin gespalten wurden.
Beim Vergleich von Furin-vermittelte Spaltung des EMC/2012 S2 “Peptid (Abbildung 1A) mit der FECV I und 4 S1/2 Peptide (Abbildung 2A), wir fanden, dass es ein ungefähre 26-fold Unterschied in der Vmax. Dies lässt sich durch das Furin Spaltung Motiv in beiden Sequenzen (Tabelle 1). Während die Mindestanforderung für Furin Dekolleté ein RXXR Motiv ist, ist eine RXRR Sequenz deutlich günstigeren2. Daher die EMC/2012 S2 “Peptid, die ein RSAR Motiv hat, ist mit weniger Genauigkeit im Vergleich zu der FECV I und 4 S1/2-Peptid, das enthält eine RSRR Furin Spaltstelle (Tabelle 1) gespalten.
Eine erhebliche Einschränkung des Tests ist jedoch, dass die Peptide nicht die Tertiärstruktur des Proteins widerspiegeln, die sie in der Regel in eingebettet sind. Spaltung des Fusionsproteins in voller Länge zeigt das Fusion-Peptid und Trigger host Cell Eintrag1. Das Zusammenspiel von Protease und Schmelzverfahren Protein könnte auch durch die tertiäre Struktur des Fusionsproteins beeinflusst werden, während wir annehmen, dass die Peptide mehr oder weniger linear sind. Spaltung in der Peptid-Test erkannt kann daher künstliche und spiegeln nicht die in-Vivo -Situation. Dies war für die Spaltung der Influenza Subtyp H3N2 HA von Matriptase berichtet. Während mehrere Gruppen Spaltung des H3N2 HA von Matriptase in Peptid Tests beschrieben, zeigte sich auch, dass die Inkubation von voller Länge H3N2 HA Protein und Matriptase in der Zellkultur eine Fusogenic HA Protein4,20nicht ergeben hat, 21. Es gibt andere Beispiele, die zeigen, dass die biologisch wichtige Regelung der proteolytischen Spaltung auf der Ebene der Protein-Konformation. Es wurde beschrieben, dass Fusionsproteine manchmal eine Reihe von Pre-fusion Veranstaltungen brauchen, Spaltstellen auf Fusion aussetzen zu können. Der Semliki Forest Virus-Fusionsprotein erfordert beispielsweise strukturelle Umstellungen während eine Anzahl von prefusion Ereignissen um seine Schmelzverfahren Protein zu entlarven und proteolytische Aktivierung22zur Verfügung stellen. Daher müssen die Ergebnisse in einem Fluorogenic Peptid-Assay von Cell Fusion Assays oder ähnlichen Experimenten validiert werden. Allerdings ermöglicht der Peptid-Test noch eine schnelle Screening von mehreren Protease/Peptid-Kombinationen und reduzieren die Arbeit und die Zeit des Follow-up-Experimente, da Kombinationen, die nicht Spaltung zeigen, sehr wahrscheinlich sind, dass das gleiche Ergebnis in Vivoaufweisen.
Die zweite große Einschränkung des Assays betrifft die Proteasen. Bisher ist es nur möglich, lösliche Proteasen aber nicht transmembranen Proteasen zu testen. Abhängig von der Absicht des Experiments kann dies ein Problem sein. Zum Beispiel sind Influenza hat durch eine Reihe von transmembranen Proteasen befindet sich in Zellmembranen8aktiviert. Bis zu einem gewissen Grad dieses Problem umgangen werden kann, mithilfe der löslichen proteolytischen aktive Domains, aber die Ergebnisse mit Vorsicht interpretiert werden müssen und sollten mit konventionellen Methoden validiert werden. Wir wollen auf dem vorgenannten Beispiel mit Matriptase und seine Tätigkeit in Richtung H3N2 HA verweisen. In Vivo Matriptase befindet sich in der Zellmembran, aber die im Handel erhältliche Enzym ist die löslichen katalytische Domäne. Wie in Bezug auf die Fusionsproteine besprochen, kann es möglich, dass es erfordert auch die Full-length Protease, interagieren mit dem Full-length Protein-Substrat zu Spaltung und, dass nur einzelne Domains testen Fehlalarme führen kann.
Diese Methodik hat gezeigt, effizient, um die Spaltung von spezifischen Aminosäure-Sequenzen von Furin zu studieren. Jedoch die Anwendungen der Technik Grenzen zu jedem verfügbaren Protease (z.B.Cathepsins, proprotein Konvertase), so dass es eine nützliche Methode zum Bildschirm Peptid Kandidaten für Protease Dekolleté. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass dieser Test auch verwendet werden, kann um die Wirksamkeit von Protease-Inhibitoren zu testen und somit eine schnelle und einfach zu Werkzeug, um Bildschirm-Protein-Hemmer23 liefert.
Die Fluorogenic Peptid Spaltung Assay hier beschriebenen stellt eine Ergänzung Bioinformatic Spaltung scoring-Algorithmen, die durch eine entschlossene Protease, basierend auf die Aminosäure Eigenschaften und die Reihenfolge die Peptid-Spaltung voraussagt dar. Diese beiden Techniken in Kombination mit westlichen beflecken Techniken Tradition dient als eine effiziente Methode Protease Spaltung in Vitrozu studieren.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forschungsförderung für das MERS-Projekt präsentiert in diesem Manuskript von NIH zur Verfügung gestellt wurde, gewähren R21 AI111085. Die feline Coronavirus-Studie wurde unterstützt durch Forschung Bewilligungen von Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation und der Cornell Feline Health Center. Wir möchten auch Malik Peiris danken, die uns mit Mor213 Sequenz, bevor es öffentlich zugänglich war.
Materials
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
References
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