Un dosage de clivage du Peptide Fluorogène pour dépister l’activité protéolytique : demandes de coronavirus doper l’activation de la protéine
Summary
Nous présentons un dosage de clivage du peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide de l’activité protéolytique des protéases sur les peptides représentant le site de clivage des peptides viraux de fusion. Cette méthode peut également être utilisée sur tout autre motif d’acides aminés dans une séquence de la protéine pour tester l’activité de la protéase.
Abstract
Virus enveloppés tels que coronavirus ou influenza virus nécessitent un clivage protéolytique de leur protéine de fusion pour pouvoir infecter la cellule hôte. Souvent les virus pièce tropisme cellulaire et tissulaire et sont adaptés à des protéases cellulaires ou tissulaires spécifiques. En outre, ces virus peuvent introduire des mutations ou des insertions dans leur génome lors de la réplication pouvant influer sur le clivage, et peut ainsi contribuer à l’adaptation à un nouvel hôte. Nous présentons ici un essai de clivage du peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide des peptides mimant le site de clivage des protéines de fusion virale. La technique est très flexible et peut être utilisée pour étudier l’activité protéolytique d’une protéase unique sur nombreux substrats différents, et en outre, il permet également une exploration de l’activité des protéases multiples sur un ou plusieurs substrats de peptide. Dans cette étude, nous avons utilisé des peptides mimant les motifs de site de clivage de la protéine de spike de coronavirus. Nous avons testé humaine et chameau dérivés Moyen-Orient Respiratory Syndrome coronavirus (MERS-CoV) pour démontrer que les substitutions simples et doubles dans le site de clivage peuvent modifier l’activité de furine et changer radicalement l’efficacité clivage. Nous avons également utilisé cette méthode en combinaison avec la bio-informatique pour tester la furine activité de clivage des protéines spike coronavirus félin de souches et sérotypes différents. Cette méthode à base de peptides est moins labor – et temps intensif que les méthodes conventionnelles utilisées pour l’analyse de l’activité protéolytique des virus, et les résultats peuvent être obtenus dans une seule journée.
Introduction
Fusion virale avec la membrane cellulaire de l’hôte est une étape cruciale dans le cycle de vie des virus enveloppés et facilite l’entrée dans la cellule et la réplication du virus. En règle générale, les virus possèdent une protéine spécialisée (ou protéines) qui se lie aux récepteurs sur la membrane cellulaire de l’hôte et déclenche le virus-cellule membrane fusion1. Protéines de fusion virale ont été regroupées en trois grandes classes (I-III)1. Un certain nombre de virus qui sont actuellement une préoccupation majeure pour la santé publique, tels que les virus de la grippe (représentant une émergence zoonotique depuis longue des oiseaux) et Moyen-Orient respiratoire Syndrome-coronavirus (MERS-CoV) (ce qui représente une récente zoonotiques émergence de chameaux), utilisent ce qu’on appelle des protéines de fusion, qui nécessitent un traitement protéolytique par des protéases de l’hôte, d’exercer leur activité fusogène2de classe I. De même, les coronavirus félin (FCoV), qui représente une menace grave pour les chats sauvages et domestiques, possèdent également une classe j’ai protéine de fusion. Classe I fusion virale protéines sont synthétisées en général comme un précurseur clivé et sont généralement consistant de deux domaines qui sont responsables de récepteurs contraignant et le déclenchement de l’événement de fusion respectivement. A ce jour, l’hémagglutinine de grippe (HA) est le meilleur compris protéine de fusion et de nombreuses études ont décrit son rôle mécaniste dans d’entrée et la fusion cellulaire hôte3. Dans ce cas, le clivage de la protéine de fusion se produit à une séquence spécifique ou un site de clivage au sein de l’AP et en combinaison avec des changements conformationnels dépendante du pH, des résultats de l’exposition du peptide fusion virale1,2.
Le peptide de fusion et sa séquence de reconnaissance précédente protéase sont critiques pour la pathogénicité et l’adaptation de l’hôte du virus. Changements dans la séquence de reconnaissance protéase peuvent altérer clivage significative avec des conséquences potentiellement dramatiques pour le virus et l’ hôte4. D’une part, il peut abroger un clivage et éliminer ainsi le cycle de vie du virus. Mais en revanche, une mutation peut augmenter la spécificité de substrat pour une protéase donnée et/ou permettre une protéase « nouveau » en conjonction avec la protéine de fusion. Par la suite, cela peut également développer le tropisme cellulaire et tissulaire, comme observé, par exemple, avec l’influenza virus sous-types5,6. Généralement faible des virus de la grippe aviaire (LPAI) de pathogénicité et virus de l’influenza humaines plus sont confinés au tractus digestif ou respiratoire en raison de la localisation limitée des protéases qui activent leur. En règle générale, le peptide de fusion de ces protéines HA est précédée d’une séquence 4-amino d’acide qui se compose d’acides aminés basiques non consécutifs de 1-2, qui est reconnue par la trypsine sérines protéases comme la trypsine, matriptase ou TMPRSS27, 8. quand le virus acquiert des insertions ou des mutations qui modifient le site de clivage vers un site polybasiques, il permet la furine pour activer l’AP et potentiellement provoquer une beaucoup plus sévère infection systémique6,9. Ces virus sont appelés virus de l’influenza aviaire hautement pathogène (IAHP), caractérisé par des souches H5N1.
Contrairement à la grippe HA, nombreux coronavirus, comme les MERS-CoV, ont deux sites de clivage distinct au sein de leur protéine de spike. Le site de S1/S2 sépare le domaine N-terminal de liaison du récepteur (S1) le domaine C-terminal de la fusion (S2), avec un second site de clivage, appelé S2′, en aval du site S1/S2, à proximité de la peptide de fusion10. Il a été suggéré que les sites sont clivés séquentiellement, à S1/S2 suivie S2′. Contrairement à l’AP de plupart souches de virus de la grippe, la protéine S MERS-CoV S1/S2 et S2′ sites peuvent être reconnus par des protéases de la famille de la proprotéine convertase (PC), comme la furine. Membres de cette famille s’attacher à des résidus basiques appariés avec le motif R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. En règle générale, les acides aminés en amont du site de clivage sont appelés P1, P2, P3, etc.. comptant à partir du site de clivage et les acides aminés en aval sont désignés comme P1′, P2′, P3′, etc.. 11. FCoV souches peuvent avoir un seul ou un site de clivage double. Comme les MERS-CoV, certaines souches FCoV possèdent également deux sites de clivage (S1/S2 et S2′) dans leur protéine S. Cependant, cette caractéristique est l’exclusion sérotype j’ai FCoVs (clade A). En revanche, les membres du groupement sérotype II (clade B) ont seulement un site unique clivage (S2′)2,12. Plusieurs protéases ont été suggérées en conjonction avec les sites de clivage FCoV, y compris furine, protéases de trypsine et cathepsine. Il a été proposé que la protéine S de FCoV entérique (également connu sous le nom de feline coronavirus entérique ou FECV) est susceptible d’être clivée par furine dans le site S1/S2 et mutations dans ce site (ainsi qu’à S2′) entraîne des changements dans les exigences de la protéase. Ces mutations ont été associées à des changements dans le tropisme et la pathogénicité de ces virus, permettant au virus de devenir systémique et le macrophage-tropic (virus de la péritonite infectieuse féline également connu sous le nom ou FIPV)13.
Virus introduisent naturellement des mutations dans leurs génomes au cours de chaque cycle de réplication et fréquemment de nouveaux sous-types et les souches de la grippe, MERS-CoV et FCoV sont décrit14,15,16. Dans le cadre d’une évaluation rapide afin d’évaluer la menace de santé publique des virus émergents, il est essentiel de cerner l’évolution du site de clivage et comment il affecte l’éventail des protéases activant ces virus. Nous décrivons ici un essai à base de peptides qui permet une évaluation rapide des conséquences des changements de site de clivage en protéine S MERS-CoV sur la spécificité de substrat d’une protéase donnée et pour dépister rapidement les différentes protéases pour leur capacité à s’attacher une donnée ou plusieurs séquences4. Dans une deuxième série d’expériences, nous avons utilisé la technique pour déterminer l’activité de clivage furine sur souches et sérotypes différents de FCoV.
Les peptides utilisés dans cet essai sont complétés par la fluorescence resonance energy transfert (FRET) paire, 7-méthoxycoumarine-4-yl acétyle (MCA) à l’extrémité N-terminale et N-2, 4-dinitrophényl (DNP) à l’extrémité C-terminale. Pendant le test, le MCA est excité et émet de l’énergie lumineuse qui est piégée par DNP, aussi longtemps que la paire est à proximité immédiate les uns aux autres. En cas de clivage, cependant, DNP ne parvient pas à étancher l’émission plus et il peut être lu par le lecteur de plaque de fluorescence. Les changements dans la fluorescence est mesurée au cours de l’expérience pour déterminer le taux de clivage du peptide et pour calculer la vitesse à laquelle la protéase fend le peptide spécifique (également connu sous le nom de Vmax)17.
Après la guerre, afin de concevoir les peptides, le gène de la protéine de fusion respectifs doit ont été séquencé ou mis à disposition dans une base de données. Toutefois, la méthode est moins coûteuse que les méthodes conventionnelles qui exigent habituellement le clonage du gène de protéine de fusion dans des vecteurs d’expression de l’exprimer dans des cellules de mammifères pour analyser le clivage et labor-intense. Du début à la fin, cela peut prendre plusieurs jours jusqu’à quelques semaines alors que les dosages de peptide présentés ici peuvent être faits dans la journée, dès que les peptides et les protéases sont disponibles. La configuration du test prend entre 5 et 30 min en fonction du nombre d’échantillons et le runtime dans le lecteur de fluorescence est 1 h. analyse des données peut prendre jusqu’à 2 h, là encore selon la taille de l’échantillon.
Ici, nous avons choisi deux exemples différents de présenter le test. Dans le premier exemple, nous présentons des données qui compare le clivage furin-mediated des MERS-CoV humain et dérivés de chameau, pour évaluer le potentiel des souches dérivées de chameau d’être activé chez l’être humain s’ils franchissent la barrière des espèces. Dans le deuxième exemple, nous avons utilisé un dosage du peptide fluorogène pour déterminer le clivage furin-mediated des S1/S2 et S2′ sites ou S2′ site de deux sérotypes j’et souches de sérotype deux de FCoV II, respectivement. Pour ces expériences, nous avons utilisé le clivage de la trypsine comme témoin positif.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons ici un essai de peptide fluorogène qui permet un dépistage rapide des séquences de protéines pour leur clivage protéolytique par des protéases. Dans notre premier exemple, nous avons choisi un clivage différent motifs du site de la protéine de spike (S) des MERS-CoV pour illustrer une application avec ce test. Plusieurs enveloppé virus qui possèdent la classe j’ai fusion des protéines telles que les MERS-CoV, le SRAS (Syndrome respiratoire aigu sévère) et la grippe sont des préoccupations majeures pour la santé publique et de nouveaux sous-types sont en constante évolution qui ont un potentiel de traverser des espèces barrières de leurs hôtes naturels à l’homme1,15,16. Isoler les virus et les cultiver en laboratoire ne peuvent pas toujours être réalisables ou nécessite des laboratoires spéciaux qui ne sont pas disponibles dans chaque centre de recherche. Par conséquent, il est nécessaire pour les méthodes d’évaluation de la menace potentielle de la santé publique des virus émergents qui peuvent être effectués en laboratoire régulières. Outre les virus ciblant les humains, certains virus animaux comme FCoV possèdent également les mêmes protéines de fusion, par conséquent, partage les mêmes caractéristiques que leurs homologues humains de classe I. Isoler ces virus peut également être un défi, rendre l’utilisation d’outils innovants pour étudier leur nécessaire.
Une étape cruciale dans le cycle de vie des virus susmentionnés est entrée de cellule hôte et fusion médiée par traitement protéolytique de la protéine de fusion respectifs par le hôte protéases1,2. Un standard pour enquêter sur cette partie du cycle de vie viral consiste à cloner le gène de la protéine de fusion dans un vecteur d’expression chez les mammifères, des cellules de mammifères qui permettant l’expression de la protéine, incuber ou transfecter conjointement avec la protéase d’intérêt, l’isolat de transfecter les protéines et effectuer une analyse par western blot. Cette méthode est livré avec plusieurs limitations : disponibilité d’ADN/ARN viral pour le clonage, les coûts pour la synthèse du gène si aucun ADN ou ARN n’est disponible, la disponibilité d’un anticorps pour détecter la protéine de fusion et de ses produits de clivage et il peut prendre jusqu’à plusieurs semaines jusqu’à ce que l’ensemble de l’étude est effectuée. Il devient encore plus d’argent, de temps et main-d’oeuvre si l’intérêt de l’étude est d’étudier plusieurs mutations dans le site de clivage, car elle nécessite de mutagenèse dirigée. Le dosage du peptide fluorogène que nous décrivons ici n’a pas ces limites. Les peptides d’intérêt peuvent être conçus selon des séquences accessibles au public, il y a plusieurs fournisseurs qui offrent un large éventail de protéases recombinants qui sont pertinentes pour ces types d’études et l’essai, y compris l’analyse peut être effectuée dans un seule journée.
Dans notre exemple, nous avons examiné la furine médiée par clivage de la S2′ site de reconnaissance de protéase de la protéine S MERS-CoV provenant des humains et des dromadaires d’Égypte et du Maroc. Fois l’humain EMC/2012 et le chameau HKU205 S2′ sites contiennent un motif de clivage de la furine RXXR typique. Toutefois, selon le clivage PiTou 2.0 notation algorithme le S2 HKU205′ site n’est pas prévu pour être clivée par furine, que nous avons confirmé expérimentalement19. La raison pourquoi HKU5 S2′ n’est pas traité par furine pourrait être due à l’isoleucine dans le P1′ position. Lorsque nous avons testé deux peptides qui a effectué les mutations individuelles dans la S2 EMC/2012 ‘ séquence, nous avons pu confirmer que l’isoleucine dans le P1′ abroge largement décolleté alors que l’alanine à la substitution de sérine conduit à une coupure réduite. Le S2 Mor213′ site ne contient pas un motif de clivage de furine et il n’est pas surprenant de ne détecter presque aucun clivage. Nous avons également examiné comment furine fend le S1/S2 et S2’ sites de reconnaissance de protéase de la protéine FCoV S. Nous avons pu observer la furine clivage des deux peptides FECV (FECV I et 4 S1/S2 et S2 FECV II 1683 »), tandis que mutés séquences du virus de la FIPV n’étaient pas clivés par furine.
Lorsque l’on compare la furine médiée par clivage de l’EMC/2012 S2 “peptide (Figure 1 a) avec les peptides FECV I et 4 S1/2 (Figure 2 a), nous avons constaté qu’il existait une 26-fold différence approximative la Vmax. Cela peut s’expliquer par le motif de clivage furine dans les deux séquences (tableau 1). Alors que le minimum requis pour le clivage furin est un motif RXXR, une séquence RXRR est beaucoup plus favorable2. Par conséquent, le S2 EMC/2012 “peptide qui présente un motif RSAR, est clivé avec moins de précision par rapport au peptide FECV I et 4 S1/2 qui contient un site de clivage de la furine RSRR (tableau 1).
Toutefois, une limitation majeure de l’analyse est que les peptides ne reflètent pas la structure tertiaire de la protéine, dans qu’ils sont généralement intégrés. Clivage de la protéine de fusion pleine longueur expose le peptide de fusion et déclencheurs d’accueil cellule entrée1. L’interaction entre la protéine protéase et de la fusion pourrait également être affectée par la structure tertiaire de la protéine de fusion même si nous supposons que les peptides sont plus ou moins linéaires. Par conséquent, clivage détecté dans le dosage du peptide peut être artificiel et peut-être ne pas refléter la situation in vivo . Cela a été rapporté pour le clivage de l’influenza de sous-type H3N2 HA par matriptase. Alors que plusieurs groupes décrivent un clivage du H3N2 HA matriptase lors d’essais de peptide, il a également été montré que l’incubation de H3N2 HA protéine pleine longueur et matriptase en culture cellulaire n’a pas entraîné une fusogène HA protéine4,20, 21. Il y a d’autres exemples qui montrent que le règlement biologiquement important du clivage protéolytique est au niveau de la conformation des protéines. Il a été décrit que des protéines de fusion ont parfois besoin d’une série d’événements pré fusion pour pouvoir exposer les sites de clivage à la fusion. La protéine de fusion virus Semliki Forest, par exemple, exige des réarrangements structuraux pendant un certain nombre d’événements prefusion pour exposer sa protéine de fusion et la rendre disponible pour une activation protéolytique22. Par conséquent, les résultats obtenus lors d’un essai de peptide fluorogène doivent être validés par des essais de fusion des cellules ou des expériences similaires. Toutefois, le dosage du peptide permet toujours un dépistage rapide de plusieurs combinaisons de protéase/peptide et de réduire la main-d’œuvre et le temps des expériences de suivi puisque les combinaisons qui ne présentent pas de clivage sont très susceptibles de présenter le même résultat en vivo.
La deuxième limitation majeure du dosage concerne les protéases. Jusqu’à présent, il n’est possible à tester des protéases solubles mais pas transmembranaires protéases. Selon l’intention de l’expérience, cela peut être un problème. Par exemple, la grippe a est activés par un certain nombre de protéases transmembranaires située à membranes cellulaires8. Dans une certaine mesure, ce problème peut être contourné en utilisant les domaines actifs protéolytiques solubles, mais les résultats doivent être interprétés avec prudence et doivent être validés par les méthodes conventionnelles. Nous voulons reportez-vous à l’exemple de decoule avec matriptase et son activité vers H3N2 HA. In vivo matriptase est situé dans la membrane cellulaire, mais l’enzyme disponible dans le commerce est le domaine catalytique soluble. Tel que discuté en ce qui concerne les protéines de fusion, il peut être possible qu’il exige aussi la protéase pleine longueur pour interagir avec le substrat de la protéine pleine longueur pour obtenir un clivage et que test uniquement aux domaines unique peut entraîner de faux positifs.
Cette méthodologie s’est avéré efficace pour étudier le clivage des séquences d’acides aminés spécifiques par furine. Toutefois, les applications de l’étendue de la technique à une protéase disponible (p. ex., cathepsines, proprotéine convertase), ce qui en fait une méthode utile pour sélectionner les candidats de peptide pour le clivage de la protéase. En outre, il a été démontré que ce test peut également être utilisé pour tester l’efficacité des inhibiteurs de la protéase et par conséquent fournit un rapide et facile à outil pour écran protéine inhibiteurs23.
Le dosage de clivage de peptide fluorogène décrit ici représente un ajout au clivage de bioinformatic marquant des algorithmes, qui prédit le clivage du peptide par une protéase déterminée, basée sur les propriétés des acides aminés et la séquence. Ces deux techniques, en combinaison avec la tradition western blotting techniques utilisable comme une méthode efficace pour étudier la protéase clivage in vitro.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financement de la recherche du projet MERS présenté dans ce manuscrit a été assuré par les NIH grant R21 AI111085. L’étude de coronavirus félin était soutenue par des subventions de recherche de Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation et le centre de santé de Cornell félin. Nous tenons également à remercier Malik Peiris pour nous fournir des Mor213 séquence avant c’était accessible au public.
Materials
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
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