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Abstract
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免疫与感染

Establecimiento de la infección Viral y análisis de la interacción huésped-Virus en Drosophila Melanogaster

Published: March 14, 2019
doi:
10.3791/58845
, , , , , ,
1The Joint Center for Infection and Immunity, Guangzhou Institute of Pediatrics,Guangzhou Women and Children’s Medical Center, 2CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai,Chinese Academy of Sciences, 3CAS Key Laboratory of Infection and Immunity (CASKLII), Institute of Biophysics,Chinese Academy of Sciences, 4Shanghai Institute of Biochemistry and Cell Biology,Chinese Academy of Sciences

Summary

Este protocolo describe cómo establecer infección viral en vivo de Drosophila melanogaster utilizando el método de inyección de nano y técnicas básicas para analizar interacción virus-huésped.

Abstract

Propagación del virus es una causa importante de enfermedades epidémicas. Por lo tanto, comprender la interacción entre el virus y el anfitrión es muy importante ampliar nuestro conocimiento de la prevención y el tratamiento de la infección viral. La mosca de la fruta Drosophila melanogaster ha demostrado para ser uno de los organismos modelo más eficiente y productivo de factores antivirales y investigar interacción virus-huésped, debido a poderosas herramientas genéticas e inmune innata altamente conservado vías de señalización. El procedimiento descrito aquí muestra un método de inyección de nano para establecer infección viral e inducir respuestas antivirales sistémicas en moscas adultas. El control preciso de la dosis de inyección viral en este método permite alta reproducibilidad experimental. Protocolos descritos en este estudio incluyen la preparación de moscas y el virus, el método de inyección, análisis de la tasa de supervivencia, la medición de la carga de virus y una evaluación antiviral vía. Los efectos de la influencia de la infección viral por el fondo de las moscas fueron mencionados aquí. Este método de infección es fácil de realizar y cuantitativamente repetible; se puede aplicar para detectar host viral factores que intervienen en la interacción virus-huésped y diseccionar la diafonía entre inmune innata de señalización y otras vías biológicas en respuesta a la infección viral.

Introduction

Emergentes de infecciones virales, especialmente por arbovirus, como el Chikungunya virus1, el virus del Dengue, la fiebre amarilla virus2 y elvirusZika3, han sido una gran amenaza para la salud pública al causar pandemias 4. por lo tanto, una mejor comprensión de la interacción virus-huésped se ha convertido en cada vez más importante para el control epidémico y tratamiento de enfermedades virales en los seres humanos. Para este objetivo, se establecerá modelos más adecuados y eficaces para investigar los mecanismos subyacentes a la infección del virus.

La mosca de la fruta, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), proporciona un poderoso sistema para investigar el virus host interacción5,6 y ha demostrado para ser uno de los modelos más eficientes para estudiar enfermedades virales humanas7 , 8 , 9. antiviral altamente conservado señalización vías y herramientas genéticas incomparables que vuela un gran modelo para producir resultados significativos, con implicaciones reales para estudios en humanos de antivirales. Además, las moscas son fáciles y baratos de mantener en el laboratorio y son convenientes para la investigación a gran escala de nuevos factores reguladores6,10 en el virus y el huésped durante la infección.

Cuatro principales vías antivirales altamente conservadas (por ej., el RNA de interferencia (ARNi) vía11, la vía JAK-STAT del12, la vía de NF-κB y la vía de la autofagia13) están bien estudiadas en Drosophila en los últimos años6. El camino de RNAi es un amplio mecanismo antiviral que puede suprimir la mayoría de las clases de virus infección6,14. Interrupción de esta vía por mutación en genes como Dicer-2 (Dcr-2) o 2 Argonaute (antes2) puede llevar a mayor virus título y host mortalidad15,16,17. La vía JAK-STAT se ha implicado en el control de la infección por el virus de la familia Dicistroviridae y la familia Flaviviridae de insectos, por ejemplo., el virus C de Drosophila (DCV) en moscas16 y virus del Nilo Occidental (VNO) y el Virus del Dengue en mosquitos18,19. El Toll de Drosophila (homólogo a la humana vía NF-κB) y vías (IMD) de la deficiencia inmune (similares a la vía de NF-κB y TNF humana) están involucrados en la defensa de virus invasión20,21, 22. autofagia es otro mecanismo conservado implicado en la regulación de la infección viral, que se caracteriza también en Drosophila23,24. Así, la identificación de nuevos factores reguladores de estas vías y disección interferencia entre estas señales antivirales y otras vías biológicas, tales como metabolismo, envejecimiento, reacción neural y así sucesivamente, se pueden configurar fácilmente en la Drosophila sistema.

Aunque más bien establecidos modelos infecciosos virales en Drosophila son inducidos por virus ARN, la infección por los invertebrados 6I de Virus iridiscente (IV-6) y virus de Kallithea han demostrado el potencial para el estudio de los virus ADN en moscas25, 26. Por otra parte, los virus pueden modificarse para permitir la infección de Drosophila, como el virus de la influenza9. Esto ha ampliado enormemente la aplicación de la plataforma de proyección de Drosophila . En este procedimiento utilizamos DCV como ejemplo para describir cómo desarrollar un sistema viral infeccioso en Drosophila. DCV es un virus trenzado solo ARN de sentido positivo de nucleótidos aproximadamente 9300, codificación de proteínas 927. Como un patógeno natural de D. melanogaster, DCV se considera como un virus conveniente estudiar inmunorespuesta fisiológico, conductual y basal del anfitrión durante virus host interacción y co-evolución28. Además, su rápida mortalidad después de la infección en moscas tipo salvaje hace DCV útil para detectar genes resistentes o susceptibles en el host29.

Sin embargo, hay varios aspectos de interés en el estudio de infecciones virales en Drosophila. Por ejemplo, simbióticas bacterias Wolbachia tienen una capacidad de inhibir un amplio espectros de la proliferación de virus ARN en Drosophila y mosquito30,31,32. La evidencia reciente muestra un posible mecanismo en que Wolbachia bloques Sindbis (SINV) infección por virus a través de la regulación al alza de methyltransferase expresión Mt2 en el host33. Además, el fondo genético de insectos también es crítico para la infección viral. Por ejemplo, el natural polimorfismo en el gen, pastrel (pst), determina la susceptibilidad a la infección de DCV en Drosophila34,35, mientras que los lugares geométricos de Ubc-E2H y CG8492 participan en el virus de la parálisis del grillo (CrPV) y la infección por el virus (FHV) casa rebaño, respectivamente36.

Las particulares maneras de establecer la interacción virus-huésped en moscas, deben ser elegidos según los propósitos de la investigación como una pantalla de alto rendimiento para los componentes celulares del anfitrión en Drosophila la célula líneas37,38, oral infección para estudiar respuesta antiviral específico de tripa22,39,40, aguja que pincha41,42 o nano-inyección pasando barreras epiteliales para estimular a inmunológico sistémico respuestas. Nano-inyección puede controlar con precisión la dosis viral para inducir una reacción controlada de antiviral y una lesión fisiológica43, garantizando alta reproducibilidad experimental44. En este estudio, se describe un método de inyección de nano para estudiar interacciones virus-huésped en Drosophila, resaltando la importancia de los efectos del fondo de las moscas.

Protocol

Nota: Antes de comenzar el experimento, las líneas celulares y las poblaciones de mosca utilizadas deben no ser contaminadas por otros patógenos, especialmente para virus como el DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) y virus de la nefritis aviar (ANV). Idealmente, la secuencia de RNA o una identificación de polimerización en cadena-basado más simple se utilizan para detectar contaminación10,45. Si la contaminación se produjo, las líneas celulares y las pobla…

Representative Results

Resultados de esta sección se obtienen después de la infección de DCV de D. melanogaster. La figura 1 muestra el organigrama de la infección viral en Drosophila. Moscas se inyectan intra thoracically, y luego se recogen las muestras para la medición de la viral TCID50 y el nivel de ARN del genoma (figura 1). La infección del virus puede inducir lisis celular y CPE se observa en 3 días post infección (figura 2A). De acuerdo con la carg…

Discussion

En este artículo, presentamos un procedimiento detallado sobre cómo establecer un sistema viral infeccioso en adultos de Drosophila melanogaster utilizando nano-inyección. Los protocolos incluyen la preparación de líneas moscas apropiadas y stock de virus, técnicas de infección, la evaluación de indicadores de infecciosas y la medición de la respuesta antiviral. Aunque el DCV se utiliza como un ejemplo de un patógeno viral, decenas de diferentes tipos de virus se ha aplicado con éxito para el estudio …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nos gustaría agradecer al laboratorio de Pan todo en IPS. CAS. Agradecemos Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) asistencia experimental y Dr. Gonalo Cordova Steger (naturaleza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, París) y el Dr. Seng Zhu (IPS, París) Comentarios. Este trabajo fue financiado por becas del programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias L.P (XDA13010500) y HT (XDB29030300), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China a L.P (31870887 y 31570897) y J.Y (31670909). L.P es miembro de la Asociación de promoción de innovación CAS juvenil (2012083).

Materials

0.22um filter Millipore SLGP033RS
1.5 ml Microcentrifuge tubes Brand 352070
1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes Axygen MCT-150-C
10 cm cell culture dish Sigma CLS430167 Cell culture
100 Replacement tubes Drummond Scientific 3-000-203-G/X
15 ml tube Corning 352096
ABI 7500 qPCR system ABI 7500 qPCR
Cell Incubator Sanyo MIR-553
Centriguge Eppendof 5810R
Centriguge Eppendof 5424R
Chloroform Sigma 151858 RNA extraction
DEPC water Sigma 95284-100ML RNA extraction
Drosophila Incubator Percival I-41NL Rearing Drosophila
FBS Invitrogen 12657-029 Cell culture
flat bottom 96-well-plate Sigma CLS3922 Cell culture
Fluorescence microscope Olympus DP73
Isopropyl alcohol Sigma I9516 RNA extraction
Lysis buffer (RNA extraction) Thermo Fisher 15596026 TRIzol Reagent
Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) Thermo Fisher 10296028 TRIzol LS Reagent
Microscope Olympus CKX41
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-204 Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V)
Optical Adhesive Film ABI 4360954 qPCR
Penicillin-Streptomycin, Liquid Invitrogen 15140-122 Cell culture
qPCR plate ABI A32811 qPCR
Schneider’s Insect Medium Sigma S9895 Cell culture
statistical software GraphPad Prism 7
TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix TransScript AT301 RNA extraction
Vortex IKA VORTEX 3 RNA extraction
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References

  1. Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
  2. Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
  3. Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
  4. Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
  5. Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
  6. Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
  7. Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
  8. Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. 遗传学. 189, 495-506 (2011).
  9. Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
  10. Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
  11. Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. 遗传学. 208, 853-874 (2018).
  12. West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
  13. Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
  14. Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
  15. van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
  16. Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
  17. Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
  18. Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
  19. Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
  20. Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
  21. Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
  22. Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
  23. Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
  24. Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
  25. Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
  26. Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
  27. Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
  28. Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
  29. Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
  30. Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
  31. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
  32. Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
  33. Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
  34. Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
  35. Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. 遗传学. , 2159-2173 (2017).
  36. Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
  37. Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  38. Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
  39. Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
  40. Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
  41. Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
  42. Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
  43. Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
  44. Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
  45. Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
  46. Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
  47. . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
  48. Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
  49. Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
  50. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
  51. Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
  52. Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
  53. Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).

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Yang, S., Zhao, Y., Yu, J., Fan, Z., Gong, S., Tang, H., Pan, L. Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (145), e58845, doi:10.3791/58845 (2019).
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