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癌症研究

Preparación de exosomas siRNA entrega a las células cancerosas

Published: December 05, 2018
doi:
10.3791/58814
, ,
1Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London

Summary

Un exosomas es una nueva generación de compañías de entrega de drogas. Hemos establecido un protocolo de aislamiento de exosomas con alto rendimiento y pureza para entrega de siRNA. También había encapsulado con fluorescencia inespecífica siRNA en exosomas y había investigado la absorción celular de exosomas cargado de siRNA en las células cancerosas.

Abstract

Vesículas extracelulares, en particular exosomas, recientemente han cobrado interés como fármaco nuevo vectores de entrega debido a su origen biológico, la abundancia y la capacidad intrínseca en intercelular entrega de diversas biomoléculas. Este trabajo establece un protocolo de aislamiento para lograr altos rendimientos y alta pureza de los exosomas para entrega de siRNA. Células de riñón embrionario humanas (células HEK-293) se cultivan en matraces de biorreactor y el sobrenadante de cultivo (de aquí en adelante denominado medio condicionado) se recolecta semanalmente para permitir el enriquecimiento de exosomas HEK-293. El medio condicionado (CM) es preaprobado de células muertas y los desechos celulares por centrifugación diferencial y se somete a ultracentrifugación en un colchón de sacarosa seguido por un paso de lavado, para recoger los exosomas. Aislado HEK-293 exosomas se caracterizan por producción, morfología y exosomal expresión de marcador por nanopartículas seguimiento análisis, cuantificación de proteínas, microscopía electrónica y citometría de flujo, respectivamente. ARN interferente pequeño (siRNA), fluorescencia marcado con Atto655, se carga en exosomas por electroporación y siRNA exceso se elimina por filtración en gel. Captación celular en células de cáncer PANC-1, después de 24 h de incubación a 37 ° C, se confirma mediante citometría de flujo. HEK-293 exosomas son 107.0 ± 8.2 nm de diámetro. La relación de cociente (EIII) de rendimiento y proteína de partículas de exosomas son 6,99 ± 0.22 × 1012 partículas/mL y 8,3 ± 1,7 × 1010 partículas/μg, respectivamente. La eficiencia de encapsulación de siRNA en exosomas es ~ 10-20%. Cuarenta por ciento de las células muestran señales positivas para Atto655 a las 24 h después de la incubación. En conclusión, aislamiento de exosomas por ultracentrifugación en colchón de sacarosa ofrece una combinación de buenos rendimientos y pureza. siRNA podría ser cargado con éxito en exosomas por electroporación y posteriormente entregado a las células cancerosas in vitro. Este protocolo ofrece un procedimiento estándar para el desarrollo de exosomas cargado de siRNA para un suministro eficiente a las células cancerosas.

Introduction

Exosomas son un subtipo de las vesículas extracelulares (EV) oscilan entre 50 y 200 nm de diámetro, secretada por varios tipos celulares como las células inmunes1,2, cáncer de células de3,4,5, 6 y células madre7. Exosomas también han demostrado para estar presente en varios fluidos fisiológicos8,9,10,11. La combinación de la capacidad inherente de exosomas para llevar varias biomoléculas (p. ej., RNA y proteínas)12,13,14 y la entrega efectiva de estas biomoléculas en células receptores 15 , 16 , 17 despertó interés por su potencial como vectores de entrega de drogas de nano-escala. Varias pequeñas moléculas que sirven como medicamentos anticancerosos y antiinflamatorios han sido demostrados ser cargado con éxito en exosomas y entregado a Diana las células18,19,20, 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. Curiosamente, los ácidos nucleicos como siRNA28,29 y microRNA30 también ha descargado con éxito en exosomas a través de electroporación y entregado a las células diana.

RNA de interferencia (ARNi) vía pequeño arn interferente (siRNA) ha ganado recientemente mayor interés como el mecanismo preferido en silenciamiento génico debido a su alta especificidad, potente efecto, efectos secundarios mínimos y facilitar la síntesis de siRNA28, 29. siRNAs son moléculas de ARN de doble cadena que van desde 19 a 25 nucleótidos de longitud caída de mRNA catalítico desencadenantes específicos de la secuencia. Debido a su gran peso molecular y naturaleza polyanionic, absorción pasiva de desnudo siRNA en las células es obstaculizada28,29. También no es posible para el ARNsi desnudo que se inyecta en la circulación sistémica debido a la rápida degradación por las nucleasas de plasma31. Por lo tanto, encapsulación de siRNA en un nanocarrier ayudaría la entrega efectiva y la absorción de siRNA en las células diana.

Exosomas son un sistema ideal para la encapsulación de siRNA como su estructura se compone de un núcleo hueco, acuoso, envuelto por una bicapa de fosfolípidos. Exosomas no sólo tienen buena estabilidad en la sangre sino también propiedades naturales dirigidos a entregar el RNA funcional en células32. El estudio realizado por Álvarez Erviti et al. , con éxito demostrado entrega efectiva de siRNA a los cerebros de ratones mediante ingeniería exosomas con prácticamente no hay complicaciones31. Se presume que la terapia basada en exosomas es relativamente más segura que otras terapias como exosomas no replicar endógeno como las células y por lo tanto no exhiben características metastásicos15.

Varios métodos se han divulgado para aislar con éxito exosomas en cultivo de células o fluidos fisiológicos. El método más popular utiliza ultracentrifugación para pellets exosomas de la partida material31,32,33. Este método puede ser bastante áspero en los exosomas y generalmente Co precipita proteínas de la muestra. Combinación de ultracentrifugación con una separación de densidad como gradientes de sacarosa es cada vez más comunes, para reducir la contaminación de la proteína y no exosomal en los exosomas aislado19,34. Cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) permite la separación de exosomas de otros tipos de vesículas extracelulares (EV) por tamaño y también puede resultar en contaminación de proteína mínimo pero está limitada por la pequeña cantidad de material puede procesar35, de partida 36. Captura de inmunoafinidad utiliza granos recubiertos con anticuerpos que se unen a proteínas de la superficie exosomal tetraspaninas como otro marcador específico de célula que permite la captura específica de exosomas en lugar de EVs u otras proteínas, así como aislamiento de la subpoblación de exosomas de muestras de todo, pero otra vez está limitado por la cantidad de material de partida y es costoso36,37. Precipitación con polímeros de exosomas solía ser muy popular, pero ya que es una precipitación bastante cruda, conduce a un mayor no exosomal vesícula y proteína contaminación38,39.

La electroporación se ha divulgado para su ineficacia como método para cargar los exosomas con siRNA debido a la agregación de proteína15,28,31. Enfoques basados en la transfección fueron demostrados para tener carga mejor eficiencia y estabilidad de la proteína, pero no es deseables debido a su toxicidad y efectos secundarios de los agentes de transfección en la alteración de la expresión de genes celulares28. Así, la electroporación se ha utilizado más ampliamente en carga de siRNA en exosomas y este es un método más seguro. Sin embargo, un método de encapsulación optimizado debe establecerse para proporcionar cantidades adecuadas de siRNA al sitio de destino para una caída de gene potente.

Aquí, proponemos un protocolo de aislamiento de exosomas utilizando ultracentrifugación basados en densidad en apenas un solo 25% (w/w) sacarosa amortiguador preparado en óxido de deuterio, en lugar de un gradiente de densidad de sacarosa. Este es un método económico que evita la preparación de gradiente de densidad laborioso y permite el procesamiento de grandes volúmenes de material de partida, sin embargo resulta en exosomas intactas de alto rendimiento y pureza adecuada para la carga posterior con ARNsi. Fluorescente Atto655-conjugado inespecífico siRNA se ha cargado en exosomas por electroporación de riñón embrionario humano en células (las células HEK-293) y entregado a las células cancerosas de adenocarcinoma de páncreas humano (PANC-1) in vitro.

Protocol

1. célula cultura en un matraz de biorreactor Figura 1: cultivo de células en matraz de biorreactor para la producción de exosomas. (A) simplificado anatomía del frasco del biorreactor. (B) a partir de la cultura en el frasco del biorreactor. Véase Tabla de materiales para la composición de los exosomas-agotado y normal medio (C) cosechar acondicionado medio (CM) y el mantenimiento de la cultura en el frasco del biorreactor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Las células HEK-293 en el medio normal de la cultura (véase Tabla de materiales; 5% CO2, 37 ° C) y ampliarlas en 4 matraces de x T75 (hasta 90% confluente). Mojar la membrana del matraz biorreactor mediante la adición de 50-100 mL de medio normal en el depósito medio del frasco de biorreactor. Recoger todas las células de HEK 293 4 x T75 y resuspender en 15 mL de medio de exosomas-agotado (véase Tabla de materiales). Añadir la suspensión de células HEK-293 del compartimiento celular del frasco de biorreactor utilizando una jeringa de 20 mL conectada a un relleno de Romo (véase Tabla de materiales), de la aguja con cuidado para eliminar cualquier burbuja que pueda haberse formado. Llene el depósito medio del frasco de biorreactor con medio normal hasta 500 mL y guardar el frasco en el incubador (5% CO2, 37 ° C) durante una semana. 2. acondicionado medio (CM) cosecha del frasco del biorreactor Después de 1 semana, Deseche todo el medio en el depósito medio del frasco de biorreactor. Quitarlo del medio en el compartimento de la célula (es decir, CM) utilizando una jeringa de 20 mL conectada a una aguja embotada relleno. Añadir 50-100 mL de medio normal al embalse de mediano. Añadir 15 mL de medio de exosomas-agotado del compartimiento celular quitando el medio viejo y agregando fresco medio agotado de exosomas utilizando una jeringa de 20 mL conectada a una aguja embotada relleno. Llene el depósito medio del frasco de biorreactor con medio normal hasta 500 mL y guardar el frasco en el incubador (5% CO2, 37 ° C) para la otra semana.Nota: La cultura puede ser continuada por más de un año. Para el paso 2.2, el CM de la primera cosecha no se utilizará para el aislamiento de exosomas y se descarta. Para el 2º y posterior cosecha, el CM se mantiene para el aislamiento de exosomas. 3. exosomas aislamiento sobre un colchón de sacarosa Figura 2: aislamiento y caracterización de exosomas. (A) claro antes cosechado medio condicionado (CM) de las células muertas y restos celulares. (B) aislamiento de exosomas de CM sobre colchón de sacarosa. (C) paso lavado para eliminar proteínas contaminantes y sacarosa. (D) aislada exosomas luego fueron sometidas a caracterización fisicoquímica, bioquímica y morfológica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Pre-claro el CM (del paso 2.2) por filtración y centrifugación diferencial como sigue. Centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 ° C. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo y descartar el precipitado. Repita este paso centrifugación una vez más, recuperando el sobrenadante y descartar el precipitado. Centrifugar el sobrenadante del paso 3.1.1 a 2.000 x g durante 15 min y 4 ° C y luego deseche el pellet. Filtrar el sobrenadante recuperado una vez que a través de 0,22 μm filtros. Durante la compensación, preparar 25% solución de sucrosa (w/w) en óxido de deuterio con precisión de pesaje 1,9 g (± 0,001 g) de sacarosa en un tubo universal y luego rellenar con óxido de deuterio hasta que el peso llega a 7,6 g (± 0,001 g). Una ultracentrífuga se llenan del tubo (véase Tabla de materiales) con 22,5 mL de previamente despejado CM. CM 22,5 ml con 0.22 μm filtrado PBS si el volumen corriente es menor. Lugar un vidrio pipeta (véase Tabla de materiales) en el tubo y, a través de ella, añadir 3 mL de solución de sacarosa para que la solución forma una capa separada debajo de la CM. Cuidadosamente en lugar el tubo que contiene capas de solución de sacarosa/CM en el cubo de un rotor de salida (véase Tabla de materiales) y el cubo en el rotor. Coloque el rotor en la ultracentrífuga (véase Tabla de materiales) y vuelta a 100.000 x g durante 1,5 h a 4 ° C. Recolectar 2 mL de la capa de sacarosa y añadir esto a una botella de ultracentrífuga (véase Tabla de materiales) que contiene 20 mL de filtrado PBS para un paso de lavado. Colocar los tubos en un rotor de ángulo fijo (véase Tabla de materiales) y vuelta a 100.000 x g durante 1,5 h a 4 ° C. Con cuidado quite el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL y resuspender el precipitado con 400 μL filtrado PBS. Mantener esta acción de exosomas a 4 ° C o -80 ° C para almacenamiento a corto plazo y largo plazo respectivamente. 4. Caracterización de exosomas tamaño y rendimiento por nanopartículas seguimiento análisis (NTA) Hacer 1:1, 000-1:50, 000 diluciones de lo exosomas stock en volumen de 1 mL (mínimo 750 μL) con el fin de obtener partículas de 20-80 en el marco de la visión de la NTA del instrumento (véase Tabla de materiales) pantalla. Inyectar la población diluido exosomas en el compartimiento de medición del instrumento NTA utilizando una jeringa de 1 mL e Introduzca la sonda de temperatura de un termómetro en la entrada de sonda de temperatura. Configure el software NTA (véase Tabla de materiales) para el registro como sigue: 3 medidas estándar, 30 s cada uno, opción manual de temperatura sin control; e introduzca el factor de dilución en la pestaña avanzado . Establecer el nivel de la cámara 13 y ejecutar el script de captura en el software NTA, inyectar un nuevo lote de la muestra y entrar en la temperatura de la cámara de muestra cuando se le pida después de cada lectura. Ajuste el umbral en 4 para la parte de posterior análisis y tenga en cuenta el tamaño promedio modal y la concentración de partículas de lo exosomas stock de las medidas. 5. Caracterización de la pureza de exosomas por determinación de la proporción de partículas: proteínas Medida el contenido de proteína de la población de exosomas por un análisis de proteína de (BCA) ácido bicinchoninic kit (véase Tabla de materiales) como sigue. Preparar la define estándares. Preparar el estándar de la concentración más alta (500 μg/mL) añadiendo 45 μl de la solución madre de BSA (2 mg/mL, suministrado en el kit de ensayo) a un tubo de microcentrífuga y hacerlo hasta 180 μl con PBS. Llenar 8 tubos de microcentrífuga con 90 μl de PBS. Hacer diluciones seriadas (factor: 0.5) 90 μl de BSA más alto estándar y añadir esto en la microcentrífuga 1st tubo con PBS (mezcla bien), entonces tomando 90 μl de este tubo y agregar en el tubo de microcentrífuga de 2nd . Repetir este proceso hasta el 7 º tubo de microcentrífuga. El tubo 8 será solo PBS (es decir, el espacio en blanco: 0 μg/mL). Preparar las muestras de exosomas haciendo 1:2 dilución de muestras con PBS en un volumen total de 90 μl (45 μl de la muestra, 45 μl de PBS). Preparar el BCA mezcla de reactivo de trabajo. Calcular el volumen total de BCA trabajo mezcla de reactivo necesitada (50 μL por pocillo, por duplicado, incluyendo las normas). Mezclar los reactivos BCA individuales según la siguiente proporción: 25 partes A: 24 piezas reactivo B: 1 parte reactivo C. Realizar el ensayo y análisis. Agregar 40 μl de cada muestra estándar y exosomas preparada anteriormente en un pozo de una placa de 96 pocillos (duplicados para cada estándar y muestra).Nota: Puesto que se trata de un ensayo colorimétrico, técnica de pipeteo apropiada es crucial para lograr resultados precisos. Pipetas de cambio después de agregar cada repetición estándar/muestra en cada uno de los pozos Añada 50 μl del ensayo de proteína mezcla de reactivo de trabajo en cada pozo e incubar la placa a 37 ° C durante 30 minutos.Nota: Para minimizar las desviaciones entre repeticiones, agregar el reactivo de trabajo de análisis de proteína en 1st de la repetición de una estándar/muestra, seguido del 2nd de la repetición de la misma muestra y patrón, antes de agregar el 1st repetición de otra muestra y patrón. Medir la absorbancia a 562 nm en el lector de placas (véase Tabla de materiales). Trazar una curva estándar de los valores de absorbancia de los estándares y calcular la concentración de proteína en cada muestra utilizando la ecuación de la curva. Calcular la relación partícula: dividiendo el rendimiento de exosomas obtenido anteriormente con la concentración de la población de exosomas medida por encima. 6. Caracterización de la expresión del marcador de Exosomal por citometría de flujo Incubar 15 min a temperatura ambiente (RT) 40 μl de exosomas (≥1×1011 partículas/mL) con 10 μl de gotas de látex de aldehído/sulfato (puro de la acción). Añadir 5 μl de solución de BSA de 100 μm (véase Tabla de materiales) a la mezcla de grano de exosomas para alcanzar una concentración final de 10 mM e incubar por 15 min a TA. Añadir 1 mL de PBS e incubar durante 75 min a temperatura ambiente en un tubo de microcentrífuga con suave agitación en un agitador oscilante (~ 150 rpm). Centrifugar la suspensión a 580 x g durante 5 min a temperatura ambiente y descarte el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 1 mL de solución de glicina 100 mM (véase Tabla de materiales) e incubar por 30 min a TA. Centrifugar la suspensión por 5 min a x 580 g. descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado con 1 mL de 3% FBS/PBS (véase Tabla de materiales). Repita este paso de lavado y resuspender el precipitado en 350 μl de 3% FBS/PBS. Dividir la suspensión 7 tubos, cada uno con 50 μl de la suspensión e incubar con fluoróforo conjugada anti-CD81, anticuerpos anti-CD9 y anti-CD63 y sus correspondientes controles de isotipo (1:10 dilución), respectivamente, por 45 min a 4 ° C. Mantener 1 de los tubos como un control sin manchas pero experimentando el mismo proceso. Añadir 1 mL de 3% FBS/PBS a cada tubo, centrifugar durante 5 min a x 580 g y descartar el sobrenadante. Resuspender el precipitado con 200-400 μL del 3% FBS/PBS y analizar las muestras en el citómetro de flujo (véase Tabla de materiales) en los canales adecuados. 7. Caracterización de la morfología de exosomas por microscopía electrónica de transmisión (TEM) Fijar exosomas dispersiones acuosas en concentraciones adecuadas como 1010 p/mL en solución de fijación (véase Tabla de materiales) durante 15 minutos. Las muestras de 300 mallas recubiertas de carbón cobre rejillas y dejar al aire seco. Negativamente la mancha las muestras con 0.22 acetato de uranilo acuoso filtrado μm (véase Tabla de materiales) para 4 min, seguido de dos 50% metanol/H2O lavado (véase Tabla de materiales). Secar la muestra. Observar las muestras en TEM (véase Tabla de materiales). Ajustar la tensión de aceleración a 80 kV y el tamaño del punto en 2. Utilice objetivo apertura con todas las muestras. 8. siRNA encapsulación en exosomas por electroporación Pre-enfriar la cubeta de electroporación (véase Tabla de materiales) en hielo durante 30 minutos antes de la electroporación. Mezcla de 7.0 μg de exosomas (32 μl de 7 x 1012 stock de p/mL en PBS) con 0,33 μg de siRNA (12 μl del stock 2 de μm en agua libre de ARNasa) en el tubo de microcentrífuga. Completar el volumen hasta 150 μL de tampón de ácido cítrico (véase Tabla de materiales). En este caso los exosomas siRNA relación molar es 1: 60. Transferir la mezcla a la cubeta de electroporación. Tapa de la cubeta y colocar en el soporte de la cubeta de la electroporator (véase Tabla de materiales). Gire la rueda de giro 180° en sentido horario.Nota: La rueda debe girarse completamente a la posición de bloqueo, en orden para la cubeta en contacto con los electrodos. Seleccione el programa deseado electroporación (p. ej., X-01, X-05, A-20, T-20, T-30, etc.) y electroporación pulsando el botón Start .Nota: Un impulso exitoso se indica mediante “Aceptar” en la pantalla. Una vez electroporated, sacar la cubeta después de vuelta atrás la rueda de 180° en sentido antihorario. Retirar la muestra de la cubeta con la pipeta de plástico para su posterior procesamiento. 9. retiro de siRNA gratis usando cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) Equilibrar la columna s (2,9 cm [H] x 1,3 cm [W]; Véase Tabla de materiales) pasando de 3,5 mL de PBS filtrada dos veces. Disolver 150 μL de la muestra electroporated en 350 μL de PBS filtrado y transferir esto a la columna de la SEC para realizar el retiro de siRNA gratis. Recoger la primera fracción de 500 μL que eluyen de la columna (F0). Añadir 500 μL de PBS filtrada a la columna y recoger la siguiente fracción de 500 μL (F1). Repita el paso anterior hasta que se recoge un total de fracciones de 10 x 500 μL (hasta F9). F1 y F2 deben contener los exosomas siRNA-encapsulado. Lavar la columna con PBS filtrada (dos veces, por lo menos) para eliminar cualquier residuo de la muestra. 10. absorción in Vitro de exosomas cargado de siRNA en células PANC-1 Las células de PANC-1 de semilla en placas de 24 pocillos fondo plano (véase Tabla de materiales) a una densidad de 50.000 células por bien 24 h antes de la absorción estudian e incuban las células en la incubadora (5% CO2, 37 ° C). Electroporate HEK-293 exosomas (7.0 μg) con Atto655-siRNA (0,33 μg) según el paso 8. Purificar el electroporated exosomas según el paso 9 y resuspender en 100 μL de PBS. Añadir 50 μL de los exosomas electroporated a PANC-1 celular e incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 4 horas. Recoger las células después de la incubación. Lavar las células con 1 mL de PBS estéril y resuspender en 200 μL de PBS de poliestireno fondo redondo del tubo (véase Tabla de materiales). Análisis de células por citometría de flujo (véase Tabla de materiales) con 10.000 eventos adquiridos por muestra.Nota: Las muestras de mezcla de exosomas siRNA ONU-electroporated y las células no tratadas con PBS filtrada fueron utilizadas como controles.

Representative Results

La caracterización fisicoquímica de exosomas aislado de las células HEK-293 (Exo HEK-293) se resumen en la tabla 1. El tamaño medido usando nanopartículas seguimiento instrumento de análisis (NTA) era 107.0 nm ± 8.2. Exosomas rendimiento de las células HEK-293, también analizada el instrumento NTA, fue de 6,99 ± 0,22 x 1012 p/mL de mL ~ 24 cm (Obtenido de 2 rondas de cosecha). Pureza de la Exo de HEK-293 que evaluó mediante el cálculo de la proporción de partículas de proteína (EIII) fue de 8,3 ± 1,7 × 1010 p/μg. La distribución de tamaño de Exo HEK-293 aislados se muestra en la Figura 3A. Análisis morfológico con microscopía electrónica de transmisión (TEM) demostraron el Exo de HEK 293 fueron estructuras esféricas ligeramente por encima de 100 nm de tamaño (figura 3B). Este resultado coincide con lo de la medición de la NTA (Figura 3A). El Exo de HEK-293 aislados eran positivas para el CD81, CD9 y CD63, que son canónicos marcadores para identificar las vesículas como exosomas (figura 3). Para la purificación de exosomas utilizando cromatografía por exclusión de tamaño (figura 4), la recuperación del porcentaje de exosomas se calculó dividiendo el número de partículas de exosomas total recuperado en las 10 fracciones recogidas (F0-F9) con los exosomas inicial número de la partícula que usa, mientras que el porcentaje de recuperación de siRNA se calculó dividiendo la intensidad de fluorescencia total obtenida de F3, F4 y F5 con la intensidad de fluorescencia total obtenida de 10 fracciones todos recogidos. La recuperación de exosomas y siRNA purificación posterior se calculó como el 75.0% y 80,4%, respectivamente. La eficiencia de encapsulación de siRNA en exosomas fue ~ 10-20%, calculado usando el siRNA curva estándar establecida (figura 4). Análisis cualitativo de la absorción en vitro de exosomas cargado con el fluorescente Atto655-siRNA por citometría de flujo mostró que células PANC-1 tratadas con siRNA-encapsulado exosomas registren el cambio más grande en la señal de fluorescencia (figura 5A) . Células de PANC-1 tratadas con siRNA-encapsulado exosomas registran un mayor porcentaje de la población positiva para la señal de Atto655 (39,4%) en comparación con el que trata con descarga mezcla exosomas y siRNA (0,56%), que corrobora la observación anteriormente ( Figura 5B). También se observó el grado de absorción celular de siRNA (expresado como la diferencia de doblez en valores de intensidad (MFI) de fluorescencia media del de las células no tratadas) a ser significativamente mayor en las células de la PANC-1 tratadas con siRNA-encapsulado exosomas (doblez MFI diferencia = 5.1) comparado con el que tratar con la mezcla de exosomas siRNA (MFI doble diferencia = 1.1) (figura 5). Estas observaciones demostraron que los exosomas siRNA-encapsulado fueron internalizados por las células de PANC-1 y que efectivamente entregaron el siRNA intracelularmente. Figura 3: Bioquímica y análisis de la morfología de los exosomas HEK-293. (A) tamaño de distribución de HEK-293 exosomas utilizando análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA). La curva muestra un histograma superpuesto de 3 diferentes capturas en intervalo de 30 s con áreas rojas que denota la desviación estándar entre mediciones (n = 3). (B) imágenes de microscopia electrónica de transmisión (TEM) de la ingenua exosomas HEK-293. Barra de escala: 100 nm. (C) detección de marcadores de exosomal CD9, CD81 y CD63 mediante citometría de flujo en exosomas HEK-293. Exosomas fueron juntados a la gotas de látex de aldehído/sulfato antes de la detección. Complejo de exosomas granos posteriormente fueron teñidas con anticuerpos anti-CD81, anti-CD9 y anti-CD63 conjugados fluoróforo. Grado de expresión de los marcadores se expresan como la diferencia de doblez en valores de intensidad (IMF) de la mediana de la fluorescencia del control (complejo de exosomas granos manchado con el isotipo correspondiente). Los valores se expresan como media ± SD, donde n = 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: exosomas purificación post-electroporación. (A) perfiles de elución (F0-F9) de Atto655-siRNA y electroporated exosomas utilizando chormatography de exclusión de tamaño. (B) NTA análisis de Atto655-siRNA y exosomas de F0 a F9 usando chormatography de exclusión de tamaño. (C) la calibración de la curva de Atto655 etiquetado siRNA. Intensidades de fluorescencia se obtuvieron mediante lector de placas a Ex / Em: 640-10/680 nm; Ganar 2800. Los valores se expresan como media ± SD (n = 3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: absorción celular de exosomas encapsulado de siRNA en las células de la PANC-1 a 4 h. (A) histogramas que compararon la absorción celular de exosomas descargado + mezcla de siRNA y encapsulado de siRNA exosomas. (B) comparación de la absorción de exosomas descargado + mezcla de siRNA a 4 h por parcela de pseudocolor. (C) la diferencia de doblez en medio de fluorescencia (IMF) valores de intensidad de las muestras analizadas en comparación con las células no tratadas. Los valores se expresan como media ± SD, donde n = 3. P < 0.001. NS: no significativo. Para análisis estadístico se utilizó ANOVA unidireccional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Exosomas Tamaño1,2(nm) Rendimiento1,2,3(p/mL) [Proteínas] 2, 4(μg/mL) A la partícula de proteína (EIII) cociente5(p/μg) HEK-293 107.0 ± 8.2 6,99 ± 0,22 x 1012 84.3 ± 9.8 de 8,3 ± 1.7 x 1010  1 medido usando nanopartículas seguimiento análisis (instrumento NTA)2 los valores se expresan como media ± SD, donde n = 33 se han obtenido rendimientos por medio de celular-condicionada de 2 rondas de recolección de frascos de biorreactor (~ 24 mL)4 medidos usando un kit de análisis de proteínas5 valor obtenido mediante la fórmula: EIII ratio = rendimiento / [proteínas] Tabla 1: Caracterización fisicoquímica de exosomas.

Discussion

Obtener un rendimiento decente exosomas de células cultivadas, que son suficientes para varias rondas de estudios in vitro o en vivo , sigue siendo un desafío. Según el fabricante, los frascos de biorreactor fueron pensados para la producción de anticuerpos y proteínas con alto rendimiento de cultivo de varias líneas celulares inmortalizadas. Esto permite que las células continuamente enriquecer el medio de cultivo con el producto deseado, resultando en un medio condicionado concentrado (CM) en el compartimiento de la célula. Teóricamente, el mismo concepto podría ser beneficioso en la producción de exosomas de varias líneas celulares y de hecho cultivo de estas células en los frascos de biorreactor fue demostrado aumentar significativamente el rendimiento de exosomas40. El gran embalse medio continuamente suministra nutrientes a y elimina desechos del compartimiento de la célula a través de una membrana semipermeable de 10 kDa, permitiendo que la cultura prolongada sin necesidad de un gran volumen de medio estar en contacto con las células, o regular frascos de cambio, que en última instancia, pueden ahorrar los costos y mano de obra de alta escala exosomas producción40. También se demostró que la morfología, fenotipo, así como las funciones inmunomoduladoras de exosomas aislaron células culturas de frascos de biorreactor a largo plazo son similares a los que provienen de las células cultivadas en regular 75 cm2 frascos40. Cultura de otras líneas celulares inmortalizadas como fuentes de exosomas en el frasco del biorreactor por lo tanto ayudaría a aumentar su producción de exosomas manteniendo su integridad y su función. Esta forma de cultura es sin embargo no se aplica a células primarias con ciclos de división limitada y los no pueden cultivarse en alta densidad.

Cosecha de la CM se hace semanalmente, y las células en cultura nunca fueron pasadas, puede ser asumido que las células en el matraz de biorreactor no están creciendo en una monocapa como cultivo celular regular. Es más probables que forman racimos con centros necróticos, o simplemente se separan de la superficie y mueren cuando las células son demasiado confluentes de una monocapa. Inspección visual del compartimiento celular del frasco de biorreactor no es posible confirmar esta hipótesis, pero se refleja en la gran cantidad de células muertas obtenida durante la recolección de CM. Eliminación regular de las células poco adherentes y no viables del frasco de biorreactor puede prevenir la acumulación de materiales sobre la membrana semipermeable que puede afectar negativamente el intercambio de gases, nutrientes y desechos entre el compartimiento de la célula y el medio depósito, permitiendo así la cultura prolongada en los frascos de biorreactor de > 6 meses40. En este contexto, esta no regularidad de crecimiento celular en los frascos de biorreactor es ideal como Especulamos que imita la condición real del tumor crecimiento en vivo más de cerca que el cultivo de células de la monocapa convencional, y se espera que los exosomas producido por el cáncer de células en el matraz de biorreactor sería más similares a la secretada por los tumores in vivo. Esto sería especialmente beneficioso en estudios que en el papel de los exosomas derivados de tumor en la progresión de la patología tumoral. Exosomas derivados de tumor han sido reportados al inicio intrínsecamente y preferencial al tejido de origen32, por lo tanto tener exosomas producida en un sistema imitando su en vivo producción también sería deseable en estudios que explorando la habilidad pasiva targeting de exosomas como drogas nanocarriers.

La relación EIII fue divulgada como un parámetro para evaluar la pureza de exosomas aislado de proteínas de medio de cultivo de fluidos fisiológicos que los exosomas provienen de41contaminantes. La relación EIII de 8,3 ± 1,7 × 1010 p/μg obtenidos en este estudio cae dentro del rango de alta pureza en el estudio. Esta relación pone de relieve el peligro de utilizar la concentración de la proteína a expresar el rendimiento o la dosis de exosomas aislado o en posteriores estudios respectivamente, como esto no refleja la verdadera cantidad de exosomas en el ejemplo dado el problema de la proteína contaminación durante el aislamiento. NTA a través de instrumentos tales como NanoSight, que mide la concentración de exosomas en términos de número de la partícula, es una forma más sensible y precisa de cuantificación de exosomas.

Pesaje de alta precisión durante la preparación de la solución de sacarosa de 25% en óxido de deuterio es crucial ya que este método es un aislamiento basado en la densidad. Exosomas tienen una gama bastante estrecha de la densidad de flotación en solución de sacarosa para que preparación precisa de la almohadilla de sacarosa reducirá contaminación de vesículas no exosomal como cuerpos apoptóticos o Golgi derivan vesículas durante aislamiento42. Se aconseja no mantener la solución de sacarosa sobrante y usando incluso después de un día para evitar el riesgo de factores que pueden alterar su densidad como la pérdida o adición de agua en la solución por evaporación o condensación de aire en el tubo. Uso de un rotor de salida también es esencial durante la centrifugación hacia el amortiguador de sacarosa para permitir incluso migración de exosomas de la CM para la solución de sacarosa.

Retirar la centrifugación posterior de solución de sacarosa también es un paso delicado, y se trata de encontrar un compromiso entre la maximización de la cantidad de exosomas recuperado y no demasiado que proteína de medio de cultivo se introduce a la muestra de exosomas retirada . La interfaz entre la solución de sacarosa y el medio de condición es donde proteínas del medio de cultivo recogen después de la centrifugación y generalmente pueden ser vistas como un anillo de color marrón oscuro que se encuentra en la interfaz. En nuestras manos, retirar 2 mL del amortiguador de la sacarosa de la inicial 3 mL agregado es el volumen óptimo que está de acuerdo con el compromiso mencionado anteriormente. Los volúmenes descritos en este protocolo son para los rotores específicos utilizados; por lo tanto, se recomienda optimizar el volumen de sacarosa para ser retirado cuando se escala hacia arriba o hacia abajo de los volúmenes de los tipos de rotores disponibles en diferentes instalaciones. También es importante evitar el derecho de la zona en el centro de la parte inferior del tubo al retirar la sacarosa, ya que es donde las partículas de mayor densidad que la sacarosa sedimentos y pueden generalmente ser visto como una pelotilla del blanco roto.

El paso de lavado con una cantidad relativamente grande de PBS ayuda a reducir aún más el grado de contaminación de la proteína durante exosomas aislamiento41. Este paso también es esencial quitar exceso sacarosa de los exosomas con el fin de evitar daños osmótica en los exosomas ellos mismos o las biomoléculas dentro del lumen de exosomal, así como reducir el riesgo de crecimiento bacteriano o fúngico en el stock de exosomas. Preparación de la solución de sacarosa en óxido de deuterio en lugar de agua ayuda a reducir la cantidad de sacarosa necesaria para lograr la densidad de flotación de exosomas para el aislamiento, por lo tanto reduciendo el riesgo de daño osmótico y contaminación microbiana. Después de la primera centrifugación en el cojín de la sacarosa, que contiene lo exosomas capa de sacarosa retirado y añadido al PBS puede almacenarse a 4 ° C y procesado al día siguiente, ante las limitaciones de tiempo.

A lo mejor de nuestro conocimiento, la relación molar de exosomas/siRNA es un factor importante en la determinación de la eficiencia de la electroporación. En este protocolo, se utilizó 1: 60 como los exosomas a fracción molar de siRNA. Como la capacidad de encapsulación de diferentes tipos de exosomas son diferentes, le recomendamos encarecidamente que se optimiza en caso por caso. Sin embargo, la eficacia de encapsulación propuesta en este documento siempre puede ser un parámetro para seleccionar las condiciones óptimas de la electroporación.

Además, la agregación de siRNA se cree para ser uno de los problemas más comunes en la electroporación. Está comprobado que la electroporación puede inducir agregación fuerte de siRNA, haciendo aún más difícil entrar en exosomas. agregaciones de siRNA se interpretan erróneamente como encapsulación de siRNA en exosomas por lo tanto apropiado controles fueron utilizados en este estudio como la formación de agregados de siRNA es inevitable durante la electroporación28. La eficiencia de encapsulación de porcentaje de nuestro método de purificación se calculó utilizando los valores normalizados para minimizar la influencia de otras fuentes tales como agregaciones de ruido, exosomas y siRNA de fondo que pueden afectar a la fiabilidad de los datos. De acuerdo con nuestros resultados, hubo agregaciones de siRNA insignificante observadas en el control muestra es decir, usando siRNA electroporated y electroporated de las Naciones Unidas.

Este protocolo ha demostrado exitosamente la encapsulación de siRNA en exosomas y su posterior transporte intracelular de lo siRNA a cáncer células in vitro. Por lo tanto, varios tipos de exosomas de diferentes líneas celulares pueden ser aislado y caracterizado usando el protocolo propuesto y cargado posteriormente con ARNsi diferentes terapéuticas para diferentes tipos de objetivos oncogénicos sobre-expresados en diferentes tipos de cáncer. Una aplicación interesante sería explorar la eficiencia de entrega y la absorción de siRNA con varias permutaciones de exosomas origen destino celular par in vitro. Esto entonces puede ser traducido a modelos animales para evaluar la eficacia de la entrega y eficacia terapéutica de exosomas siRNA-encapsulado en vivo.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F el. Faruqu N. es financiado por la agencia del gobierno de Malasia Majlis Amanah Rakyat (MARA). L. Xu es una de las becas individuales de Marie Sklodowska-Curie (horizonte 2020) (H2020-MSCA-IF-2016). K. T. Al-Jamal acepta financiamiento del BBSRC (BB/J008656/1) y Wellcome Trust (WT103913). Los autores también desean agradecer a Dr Paul Lavender y Dr. David Fear (Departamento de medicina respiratoria y alergia, College de Londres King) para ofrecer el electroporator.

Materials

Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.
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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).
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