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癌症研究

SiRNA 암 세포에 배달에 대 한 Exosomes의 준비

Published: December 05, 2018
doi:
10.3791/58814
, ,
1Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London

Summary

exosome 마약 배달 사업자의 새로운 세대입니다. 우리는 높은 수율 및 순도 siRNA 전달 exosome 격리 프로토콜을 설립. 우리는 또한 exosomes에 놓여있는지 이라는 일반적인 siRNA를 캡슐화 하 고 siRNA 로드 exosomes 암 세포에서의 세포질 통풍 관을 조사.

Abstract

특정 exosomes에 extracellular 소포 최근에 얻고 있다 관심 소설 약으로 그들의 생물 학적 기원, 풍부, 및 다양 한 생체의 세포 전달에 본질적인 기능 전달 벡터. 이 작품을 높은 수율 및 순도의 siRNA 전달에 대 한 exosomes는 격리 프로토콜을 설정 합니다. 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293 세포) 생물 플라스 크에서 교양 그리고 문화 표면에 뜨는 (hereon 조절된 매체 라고도 함)는 HEK 293 exosomes의 농축 수 있도록 매주 수확. 바른된 매체 (CM)는 미리 죽은 세포 및 세포질 파편의 차등 원심 분리에 의해 지워지고 자당 쿠션 세척 단계는 exosomes를 수집 하 여 다음에 ultracentrifugation를 복종 된다. 격리 된 HEK 293 exosomes는 특징 수율, 형태학 및 exosomal 마커 식 나노 추적 분석, 단백질 정량화, 전자 현미경, cytometry, 각각. Atto655, 라벨 붙일 작은 간섭 RNA (siRNA), electroporation에 의해 exosomes에 로드 되 고 초과 siRNA 젤 여과 의해 제거 됩니다. 37 ° C에서 24 시간 배양 후 PANC-1 암 세포에 세포 통풍 관 cytometry에 의해 확인 된다. HEK 293 exosomes 107.0 ± 8.2 nm 직경에 있다. Exosome 수율 및 입자에 단백질 비율 (P:P) 비율은 6.99 ± 0.22 × 1012 입자/mL와 µ g/8.3 ± 1.7 × 1010 입자, 각각. Exosomes에 siRNA의 캡슐화 효율은 ~ 10-20%. 셀의 40% 후 부 화에서 24 h Atto655에 대 한 긍정적인 신호를 보여줍니다. 결론적으로, exosome 격리 자당 쿠션에 ultracentrifugation 좋은 수율 및 순도의 조합을 제공합니다. siRNA electroporation에 의해 exosomes에 성공적으로 로드 될 수 있고 이후 암 세포에 전달 생체 외에서. 이 프로토콜은 암 세포에 효율적인 배달 siRNA 로드 exosomes를 개발 하기 위한 표준 절차를 제공 합니다.

Introduction

Exosomes는 50-200 nm 직경, 면역 세포1,2등 다양 한 셀 형식에 의해 분 비에서 이르는 extracellular 소포 (EV)의 하위 유형, 암 세포3,,45, 6 줄기 세포7및. Exosomes 또한 다양 한 생리 적 체액8,9,,1011에 표시 되었습니다. 다양 한 생체 (예를 들어, RNA 및 단백질)12,,1314 수행 exosomes의 고유의 능력 및 받는 사람 세포에 이러한 생체의 효과적인 납품의 조합 15 , 16 , 17 나노 약물 전달 벡터로 그들의 잠재력에 대 한 관심을 끌었다. 다양 한 작은 분자는 항 암 및 항 염증 제 약 exosomes에 성공적으로 로드 되어야 증명 되었고 대상 셀18,,1920, 에 전달 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. 흥미롭게도, siRNA28,29 및 예측에 관한30 같은 핵 산도 exosomes 통해 electroporation에 성공적으로 로드 된 있고 대상 세포에 전달.

최근, RNA 간섭 (RNAi) 통해 작은 간섭 RNA (siRNA) 얻고 있다 더 많은 관심과 선호 하는 메커니즘으로 유전자 침묵의 높은 특이성, 강력한 효과, 최소한의 부작용 및 siRNA 합성28의 용이성 때문에 29. siRNAs는 19에서 25 뉴클레오티드 길이에서 그 트리거 시퀀스 관련 촉매 mRNA 최저에 이르기까지 이중 가닥 RNA 분자. 큰 분자량 및 polyanionic 자연, 세포로 알몸 siRNA의 수동 통풍 방해28,29이다. 그것도 하지 알몸 siRNA 플라즈마 nucleases31에 의해 급속 한 저하로 인해 조직의 순환에 주입 가능. 따라서, 캡슐화는 nanocarrier에 siRNA의 대상 셀에 효과적인 배달 및 siRNA의 원조 것 이다.

Exosomes는 siRNA 캡슐화에 대 한 이상적인 시스템의 구조는 인지질 bilayer에 의해 포위 하는 빈, 수성 코어 구성. Exosomes 뿐만 아니라 혈액에 좋은 안정성을가지고 하지만 자연 대상 속성 셀32로 RNA 기능을 제공 하는. 알바 레즈-Erviti 그 외 여러분 에 의해 성공적으로 실시 하는 연구를 사용 하 여 쥐의 두뇌에 siRNA의 효과적인 전달 거의 없이 합병증31exosomes 설계 설명 했다. 그것은 exosome 기반 치료는 비교적 안전 하 게 다른 치료 보다 셀 것이 고 따라서 전이성 속성15를 전시 하지 않습니다 exosomes endogenously 복제 하지 않는 가설입니다.

다양 한 방법은 성공적으로 세포 배양 또는 생리 적 체액에서 exosomes를 분리 보고 되었습니다. 가장 인기 있는 방법 작은 시작 소재31,,3233에서 exosomes를 ultracentrifugation를 사용 합니다. 이 메서드는 exosomes 및 일반적으로 샘플에서 공동 침전 물 단백질에 아주 가혹한 될 수 있습니다. Ultracentrifugation 자당 그라디언트 등 밀도 기반 분리와 결합을 줄이기 위해 격리 된 exosomes19,34에서 단백질과 비 exosomal 오염 더 일반적인 되고있다. 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에서 분리 수 있습니다 exosomes의 extracellular 소포 (EV)의 크기에 의해 최소한의 단백질 오염을 발생 시킬 수 있습니다 하지만 시작35, 처리할 수 있는 물자의 작은 금액으로 제한 됩니다. 36. Immunoaffinity 캡처의 하위 인구를 고립 시키는 뿐만 아니라 tetraspanins 또는 exosomes 보다는 EVs의 특정 캡처 수 있도록 다른 셀 전용 마커 같은 exosomal 표면 단백질 또는 다른 단백질에 묶는 항 체로 입힌 구슬을 사용 하 여 exosomes에서 전체 샘플, 하지만 다시 시작 물자의 양에 의해 제한 됩니다 이며 비용이 많이 드는36,37. Exosomes의 강 수 폴리머 기반도, 인기를 사용 하지만 오히려 원유 강 수 때문에, 리드는 더 높은 비 exosomal 기 및 단백질 오염38,39.

Electroporation은 단백질 집계15,,2831인 siRNA와 exosomes을 로드 하는 방법으로는 비 효율에 대 한 보고 되었습니다. Transfection 기반 접근 더 나은 효율성과 단백질 안정성, 로드를 시연 했다 하지만 독성 및 세포 유전자 식28변경 transfection 요원의 부작용 바람직하지 않다. 따라서, electroporation은 안전한 방법으로 siRNA exosomes에 로드에 더 널리 사용 되었습니다. 그러나, 최적화 된 캡슐화 방법 강력한 유전자 최저에 대 한 대상 사이트에 siRNA의 충분 한 양의 제공 하기 위해 설립 될 필요가 있다.

여기, 우리는 단지 하나의 25% (w/w) 자당 쿠션 자당 밀도 기울기 보다는 중수소 산화물, 준비에 밀도 기반 ultracentrifugation를 사용 하 여 exosome 격리 프로토콜을 제안 합니다. 이것은 힘 드는 밀도 그라데이션 준비 circumvents 및 소재, 시작의 대용량의 처리 수 아직 높은 수율 및 순도 siRNA와 후속 로드에 대 한 적합 한 그대로 exosomes에서 결과 비용 효율적인 방법. 형광 Atto655 활용 된 일반적인 siRNA electroporation 통해 인간 미 발달 신장 세포 (HEK 293 세포) 파생 된 exosomes에 로드 되었고 인간의 췌 장 선 암 (PANC-1) 암 세포에 전달 생체 외에서.

Protocol

1. 세포 배양 생물 플라스 크에 그림 1: exosome 생산을 위한 생물 플라스 크에 세포의 문화. (A) 단순 생물 플라스 크의 해부학. (B) 시작 생물 플라스 크에 문화. 정상 및 exosome 고갈 중간 (C) 수확 조절 매체 (CM)의 구성과 문화 생물 플라스 크에서의 유지 보수에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 일반 매체 에서 HEK 293 세포 문화 (참조 자료의 테이블; 5% CO2, 37 ° C) (90% 합칠)까지 4 x T75 플라스 크에 그들을 확장 하 고. 생물 플라스 크의 막 생물 반응 기 플라스 크의 중간 저수지에서 일반 매체의 50-100 mL를 추가 하 여 젖은. T75 resuspend x 4에서 모든 HEK 293 세포를 수집 exosome 고갈 매체 의 15 mL에 그들 ( 재료의 표참조). 무딘 채우기에 연결 20 mL 주사기를 사용 하 여 생물 플라스 크의 셀 구획 HEK 293 세포 현 탁 액 추가 형성 수 있습니다 모든 거품을 제거 하는 주의 ( 재료의 표참조), 바늘. 기입 생물 플라스 크의 중간 저수지 일반 매체 와 500 mL, 유지 (5% CO2, 37 ° C) 인큐베이터에서 플라스 크에 일주일 동안. 2. 바른된 매체 (CM) 생물 플라스 크에서 수확 1 주일 후, 생물 플라스 크의 중간 저수지에서 모든 매체를 버리십시오. 모든 매체를 제거 무딘 채우기 바늘에 연결 된 20 mL 주사기를 사용 하 여 셀 구획 (즉, CM). 중간 저수지를 일반 매체 의 50-100 mL를 추가 합니다. 오래 된 매체를 제거 하 고 신선한 exosome 고갈 매체 무딘 채우기 바늘에 연결 된 20 mL 주사기를 사용 하 여 추가 하 여 셀 구획에 exosome 고갈 매체 의 15 mL를 추가 합니다. 기입 생물 플라스 크의 중간 저수지 일반 매체 와 500 mL, 유지 (5% CO2, 37 ° C) 인큐베이터에서 플라스 크를 다른 주에 대 한.참고: 문화 1 년 이상 계속 될 수 있다. 2.2 단계, 첫 번째 추수에서 CM exosome 절연을 위해 사용 되지 않습니다 및 삭제 됩니다. 2차 및 후속 수확, CM exosome 격리에 대 한 유지 됩니다. 3. Exosome 격리 자당 쿠션에 그림 2: 절연 및 exosomes의. (A) 전 개간 수확된 조절된 매체 (CM)에서 죽은 세포 및 세포 잔해. (B) 자당 쿠션에 CM에서 exosomes을 분리. (C) 세척 자당 및 오염 단백질 제거 하는 단계. (D) 격리 exosomes 했다 다음 물리 화학, 생화학 및 형태학 상 특성을 받게 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 미리 다음과 같이 차등 원심 분리와 여과 (2.2 단계)에서 CM를 선택을 취소 합니다. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g에서 원심 분리기 새로운 튜브에는 상쾌한 전송 및 삭제는 펠 릿. 이 원심 분리 단계를 반복 한 번 더는 상쾌한 복구 하 고 펠 릿을 삭제 합니다. 3.1.1 2000 x g 15 분 및 4 ° C에 단계에서 상쾌한 원심 고 펠 릿을 삭제. 복구 된 표면에 뜨는 한 번 0.22 μ m 필터를 통해 필터링. 전 개간, 동안 보편적인 튜브에 자당의 1.9 g (± 0.001 g)으로 정확 하 게 무게와 다음 토 핑 중수소 산화물과 무게 7.6 g (± 0.001 g)에 도달할 때까지 의해 중수소 산화물에 25% (w/w) 자당 솔루션을 준비 합니다. ultracentrifuge 채우기 튜브 ( 재료의 표참조) 사전 허가 CM. 메이크업 0.22 μ m 필터와 22.5 mL에 CM의 22.5 mL와 그 보다 작은 경우 현재 볼륨 PBS. 장소는 유리 튜브에 ( 재료의 표참조)를 플라스틱, CM 아래 별도 레이어를 형성 하는 솔루션을 자당 솔루션의 3 개 mL를 추가, 그것을 통해. 신중 하 게 튜브를 포함 하는 장소 스윙 아웃으로 터의 양동이로 CM/자당 솔루션 계층 ( 재료의 표참조)로 터에 양동이 확보. ultracentrifuge로 회전자를 배치 ( 재료의 표참조)와 1.5 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 스핀 자당 층의 2 개 mL를 수집 하 고는 ultracentrifuge 병이 추가 ( 재료의 표참조) PBS 세척 단계에 대 한 필터링의 20 mL를 포함 하. 고정 각으로 터 튜브를 넣습니다 ( 재료의 표참조)와 1.5 h 4 ° c.에 대 한 100000 x g에서 스핀 조심 스럽게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고 400 µ L 필터링 PBS 가진 펠 릿을 resuspend. 4 ° C 또는 단기 및 장기 저장을 위한-80 ° C에서 각각이 exosome 재고를 유지. 4. Exosome 크기와 나노 분석 (NTA)를 추적 하 여 항복의 특성 확인 1:1, 000-1:50, 000 희석 exosome 재고는 주권의 보기 프레임에 20-80 입자를 얻기 위하여 1 mL (최소 750 µ L) 볼륨에서의 계측 ( 재료의 표참조) 표시. 실로 NTA 악기 샘플 1 mL 주사기를 사용 하 여 희석된 exosome 주식을 주입 하 고 온도 프로브에 온도계의 온도 프로브를 삽입 합니다. NTA 소프트웨어 설정 ( 재료의 표참조) 다음과 같이 녹음: 3 표준 측정, 30 s 각, 수동 온도 옵션을 선택 하지 않은; 그리고 고급 탭의 희석 비율을 입력 합니다. 13 카메라 수준을 설정 하 고 샘플의 신선한 배치를 주입 하 고 각 독서 후 메시지가 표시 되 면 샘플 챔버의 온도 입력 NTA 소프트웨어에서 캡처 스크립트를 실행. 4 이후 분석 부분에 대 한 임계값을 설정 하 고 평균 모달 크기와 입자 농도 측정에서 exosome 재고 합니다. 5. 입자: 단백질 비율 결정에 의해 Exosome 순도의 특성 측정 한 bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과 의해 exosome 재고의 단백질 콘텐츠 다음과 같습니다 ( 재료의 표참조)을 키트. 준비는 표준 정의. Microcentrifuge 튜브에 BSA 재고 솔루션 (2 mg/mL-분석 결과 키트에 제공 된)의 45 µ L을 추가 하 여 높은 농도 (500 µ g/mL)의 표준 준비 하 고 PBS 가진 최대 180 µ L. PBS의 90 µ L로 8 microcentrifuge 튜브를 채우십시오. 직렬 희석 확인 (요소: 0.5) 표준 높은 BSA에서 90 µ L를 복용 하 고 1st microcentrifuge에이 추가 하 여 튜브 PBS (잘 믹스), 다음이 튜브에서 90 µ L를 복용 하 고 2nd microcentrifuge 튜브에 추가. 7 microcentrifuge 튜브까지이 반복 합니다. 8 튜브 그냥 PBS 됩니다 (즉, 빈: 0 µ g/mL). (샘플의 45 µ L, PBS의 45 µ L) 90 µ L의 전체 볼륨에 PBS와 1:2 희석 함으로써 exosome 샘플 을 준비 합니다. BCA 시 믹스 작업을 준비 합니다. BCA 시 혼합 필요 (잘, 중복, 표준을 포함 하 여 당 50 µ L) 작업의 전체 볼륨을 계산 합니다. 다음 비율에 따라 개별 BCA 시 약을 혼합: 25 부품 a: 24 시 부품 시 b: 1 부분 시 약 c. 분석 결과 및 분석을 수행 합니다. 각 표준 및 exosome 샘플 96 잘 접시 (각 표준 및 샘플에 대 한 중복)의 우물에 위의 준비의 40 µ L를 추가 합니다.참고:이 색도계 분석 결과 이므로, 적절 한 pipetting 기술은 정확한 결과 달성 하기 위해 중요 한 이다. 우물의 각 각 표준/샘플 복제를 추가한 후 펫을 변경 50 µ L의 단백질 분석 결과 각 음에 시 약 믹스 작업을 추가 하 고 30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.참고: 복제 사이의 편차를 최소화 하기 위해 추가 단백질 분석 결과 작업 시 약/샘플, 표준의 1세인트 복제에 이어서 1st 에 그것을 추가 하기 전에 동일한 샘플/표준의 2nd 복제 다른 샘플/표준의 복제. 562에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에 nm ( 재료의 표참조). 표준의 흡 광도 값에서 표준 곡선을 플롯 하 고 곡선의 방정식을 사용 하 여 각 샘플의 단백질 농도 밖으로 작동. 위의 측정 exosome 재고의 단백질 농도와 이전 얻은 exosome 수율을 나누어 입자: 단백질 비율을 계산 합니다. 6. Cytometry Exosomal 마커 식의 특성 실 온 (RT)에서 15 분 동안 10 µ L의 알데하이드/황산 라텍스 구슬 (주식에서 undiluted)와 exosomes (≥1×1011 입자/mL)의 40 µ L를 품 어. 100 µ M BSA 솔루션의 5 µ L 추가 ( 재료의 표참조) 10 mM 최종 농도 달성 하기 위해 실시간에 15 분 동안 품 어 exosome 비드 혼합물에 PBS의 1 mL을 추가 하 고 락 통 (~ 150 rpm)에 가벼운 동요와 microcentrifuge 튜브에 RT에서 75 분 동안 품 어. 580 x g RT에서 5 분 동안에 현 탁 액을 원심 및 삭제는 상쾌한. 100mm 글리신 솔루션의 1 mL와 펠 릿 resuspend ( 재료의 표참조) 및 실시간에서 30 분 동안 품 어 원심 580 x g. 삭제에서 5 분 동안 정지는 상쾌한 고 3%의 1 mL와 펠 릿 resuspend FBS/PBS ( 재료의 표참조). 이 세 단계를 반복 하 고 3%의 350 µ L에서 펠 릿 resuspend FBS/PBS. 정지 7 튜브, 서 스 펜 션의 50 µ L 각 분열과 fluorophore 활용 된 안티-CD81, 안티 CD9 및 안티-CD63 항 체와 그들의 해당 isotype 컨트롤 들을 품 어 (1시 10분 희석), 각각, 4 ° c.에서 45 분 1 흠 없는 제어 하지만 동일한 처리를 겪고 튜브의 유지. 3 S / PBS 각 튜브, 580 x g에 5 분 동안 원심 및 삭제는 상쾌한의 1 mL를 추가 합니다. 3%의 200-400 µ L로 펠 릿 resuspend FBS/PBS 교류 cytometer에 샘플을 분석 하 고 ( 재료의 표참조) 적절 한 채널에서. 7. 전송 전자 현미경 (TEM)에 의해 Exosome 형태학의 특성 솔루션 해결에 1010 p/mL 같은 적절 한 농도에서 exosome 수성 분산을 수정 ( 재료의 표참조) 15 분. 300에 샘플 카본 코팅 메쉬 격자 구리 장소와 공기를 떠나 건조. 부정적인 얼룩 0.22 μ m 필터링 수성 uranyl 아세테이트와 샘플 ( 재료의 표참조) 4 분 뒤에 2 개의 50% 메탄올/H2O 세척 ( 재료의 표참조). 공기 건조는 샘플. 가장 아래 샘플을 관찰 ( 재료의 표참조). 80에서 가속 전압을 설정 kV와 2 자리 크기. 객관적인 조리개를 사용 하 여 모든 샘플. 8입니다. siRNA Electroporation에 의해 Exosomes로 캡슐화 미리 진정 electroporation 베트 ( 재료의 표참조) electroporation 전에 30 분 동안 얼음에. 믹스 7.0 µ g exosomes (PBS에 7 x 1012 p/mL 재고에서 32 µ L)의 microcentrifuge 튜브에 siRNA (RNase 무료 물에서 2 µ M 재고에서 12 µ L)의 0.33 µ g. 볼륨을 연산 버퍼 150 µ L에 게 ( 재료의 표참조). SiRNA 어 금 니 비율 exosome 1:60이 경우 이다. 전송 혼합물 electroporation 베트. 모자는 멧 고는 electroporator의 베트 소유자에 ( 재료의 표참조). 터 닝 바퀴 시계 방향으로 180 ° 회전 합니다.참고: 바퀴 전극을 연결할 베트에 잠긴 위치로 완전히 설정할 수 있어야 합니다. 원하는 electroporation 프로그램 선택 (예: X-01 X-05, A-20, T-20, T-30, 등) 시작 버튼을 누르면 electroporation 시작.참고: 성공적인 펄스 디스플레이에 “확인”을 표시 하 여 표시 됩니다. Electroporated 한 번 후 다시 180 ° 바퀴 시계 반대 방향으로 베트를 제거. 추가 처리를 위해 플라스틱 피 펫과 멧에서 샘플을 철회. 9. 무료 siRNA 사용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)의 제거 SEC 열 equilibrate (1.3 x 2.9 cm [H] cm [W]; 참조 테이블의 재료) 필터링 된 PBS의 3.5 mL를 두 번 전달 하 여. 필터링 된 PBS의 350 μ에서 electroporated 샘플의 150 μ를 녹이 고 무료 siRNA 제거를 수행 하기 위해 SEC 열이 전송. 열 (F0)에서 첫 번째 500 μ 분수는 eluted를 수집 합니다. 열 필터링 된 PBS의 500 μ를 추가 하 고 500 μ 분수 (F1)를 수집 합니다. (F9) 최대 10 x 500 μ 분수의 총 수집 될 때까지 위의 단계를 반복 합니다. F1 및 F2 siRNA 캡슐화 exosomes를 포함 해야 합니다. 필터링 된 PBS 가진 열 세척 (두 번 이상) 모든 샘플 잔류물을 제거 하려면. 10. 생체 외에서 PANC-1 셀에 siRNA 로드 Exosomes의 이해 이해 하기 전에 잘 24 h 당 50, 000 셀의 밀도에 24-잘 평면-하단 플레이트 ( 재료의 표참조)에 씨앗 PANC-1 셀 공부 하 고 인큐베이터 (5% CO2, 37 ° C)에서 세포를 품 어. Atto655-siRNA와 Electroporate HEK 293 exosomes (7.0 μ g) (0.33 μ g) 8 단계에의하여. 9 단계에 의하여 electroporated exosome 정화 하 고 PBS의 100 μ에 resuspend. Electroporated exosomes의 50 μ PANC-1 셀을 추가 하 고 37 ° C, 5% CO2 4 h에서 품 어. 부 화 후 세포를 수집 합니다. 살 균 PBS의 1 mL로 세포 세척 및 폴리스 티 렌 라운드-하단에 PBS의 200 μ에 resuspend 튜브 ( 재료의 표참조). 교류 cytometer 세포 분석 ( 재료의 표참조) 10000 이벤트 샘플 당 인수.참고: 유엔 electroporated exosome siRNA 혼합 샘플 및 필터링 된 PBS 가진 치료 셀 컨트롤으로 사용 되었다.

Representative Results

HEK 293 세포 (HEK 293 엑 소)에서 분리 된 exosomes의 물리 화학적 특성은 표 1에 요약 되어 있습니다. 나노 분석 (NTA) 악기를 추적을 사용 하 여 측정 크기 107.0 ± 8.2 nm 이었다. 또한 NTA 악기를 사용 하 여 분석 HEK 293 세포에서 Exosome 항복 6.99 ± 0.22 x 1012 p/mL ~ 24 CM (수확의 2 라운드에서 얻은)의 mL에서 했다. HEK 293 엑 소 입자에 단백질 비율 (P:P)를 계산 하 여 평가의 순도 8.3 ± 1.7 × 1010 p / µ g 이었다. 격리 된 HEK 293 엑 소의 크기 분포는 그림 3A에 표시 됩니다. 전송 전자 현미경 (TEM)을 사용 하 여 형태소 분석을 보여주었다 HEK 293 엑 소 구형 구조 약간 100 nm의 크기 (그림 3B). 이 결과 NTA 측정 (그림 3A)에서 그와 함께 동의합니다. 격리 된 HEK 293 엑 소 CD81 CD9, CD63, exosomes (그림 3C)으로 소포를 식별 하는 데 사용 하는 정식 마커는 긍정적인 했다. 크기 배제 크로마토그래피 (그림 4)를 사용 하 여 exosomes의 정화에 대 한 exosomes의 비율 복구는 10 조각에서 수집 (F0-F9) 초기 exosome와 복구 총 exosome 입자 수를 나누어 계산 했다 입자 수 사용, siRNA의 백분율 복구 모든 10 분수 수집에서 얻은 총 형광 강도 F3, f 4와 f 5에서 얻은 총 형광 강도 나누어 계산 했다. 복구 exosome와 siRNA의 후 정화 각각 75.0%, 80.4%로 계산 되었다. Exosomes에 siRNA의 캡슐화 효율 10 ~ 20%, siRNA 표준 곡선 설립 (그림 4C)를 사용 하 여 계산 했다. 생체 외에서 exosomes cytometry 형광 Atto655-siRNA와 로드의 이해의 질적 분석 PANC-1 셀 siRNA 캡슐화 exosomes로 치료 (그림 5A) 형광 신호에 큰 변화를 기록 했다 . SiRNA 캡슐화 exosomes로 치료 PANC-1 세포 인구는 Atto655 신호 (39.4%)에 비해 언로드된 exosomes와 siRNA 혼합물 (0.56%), ( 위에 관찰을 뒷받침 하는 치료에 대 한 긍정적인의 더 높은 비율 기록 그림 5B). (치료 되지 않는 셀의 의미 형광 강도 (MFI) 값에 배 차이로 표현) 하는 siRNA의 세포질 통풍 관의 정도 또한 PANC-1 셀 siRNA 캡슐화 exosomes (MFI 배 취급에 상당히 높은 것으로 관찰 되었다 차이 = 5.1) exosome siRNA 혼합물으로 치료에 비해 (MFI 배 차이 = 1.1) (그림 5C). 이러한 관측 시연 siRNA 캡슐화 exosomes PANC-1 세포에 의해 내 면화 했다 그리고 그들은 효과적으로 전달 되도록는 siRNA 침. 그림 3: 생화학 및 HEK 293 exosomes의 형태 분석. (A) 나노 추적 분석 (NTA)를 사용 하 여 HEK 293 exosomes의 크기. 곡선 표시 3 가지에서 겹쳐 히스토그램 측정 사이의 표준 편차를 나타내는 빨간색 영역 30 s 간격에 캡처 (n = 3). (B) 순진한 HEK 293 exosomes의 전송 전자 현미경 (TEM) 이미지. 눈금 막대: 100 nm. (C) CD81 CD9, CD63 exosomal 마커의 검출 cytometry HEK 293 exosomes에 사용 하 여. Exosomes는 검색 전에 알데하이드/황산 라텍스 구슬에 결합 했다. 구슬 Exosome 복합물 fluorophore 활용 CD81 안티, 안티-CD9 및 안티-CD63 항 체와 스테인드 이후 했다. 마커의 표현의 정도 컨트롤 (exosome 구슬 단지 해당 isotype 물)의 중간 형광 강도 (MFI) 값에 배 차이로 표현 됩니다. 값 ± SD, 의미 표현 된다 n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: Exosome 정화 게시물-electroporation. (A) 크기 제외 chormatography를 사용 하 여 Atto655-siRNA와 electroporated exosomes의 차입 프로필 (F0-F9). (B) 주권 Atto655-siRNA와 크기 제외 chormatography를 사용 하 여 f 9에 F0에서 exosome의 분석. (C) 보정 곡선 Atto655의 siRNA 이라는. 형광 강도에서 플레이트 리더에 의해 가져온 전 / Em: 640-10/680 nm; 2800 이득. 값은 ± SD 의미 표시 (n = 3). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: 4 헤에 PANC-1 셀에 siRNA 캡슐화 exosomes의 세포질 통풍 관 (A) 히스토그램 언로드된 exosomes + siRNA 혼합물 및 siRNA 캡슐화 exosomes의 세포질 통풍 관을 비교. 언로드된 exosomes + 모조 색상 플롯에 의해 4 h에서 siRNA 혼합물의 통풍 관의 (B) 비교. (C) 의미에서 배 차이 형광 강도 (MFI) 값 테스트 샘플의 치료 세포에 비해입니다. 값 ± SD, 의미 표현 된다 n = 3. P < 0.001. NS: 중요 하지. 일방통행 ANOVA는 통계 분석을 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. Exosome 크기1, 2(nm) 1,2,3 항복(p/mL) [단백질] 2, 4(µ g/mL) 입자에 단백질 (P:P) 비율5(p / µ g) HEK 293 107.0 ± 8.2 6.99 ± 0.22 x 1012 84.3 ± 9.8 8.3 ± 1.7 × 1010  1 측정 된 나노 분석 (NTA 악기) 추적을 사용 하 여2 값은 표시 의미 ± SD, n = 33 수확량 생물 플라스 크 (~ 24 mL)에서 수확의 2 라운드에서 풀링된 세포 조절 매체에 의해 얻은4 측정 된 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여수식을 사용 하 여 얻은 5 값: P:P 비율 = 항복 / [단백질] 표 1: exosomes 물리 화학적 특성

Discussion

배양된 세포에서 괜찮은 exosome 수율을 얻기는 생체 외에서 또는 vivo에서 학문의 여러 라운드를 위해 충분히 아직도 도전 이다. 제조 업체에 따라 생물 플라스 크 항 체와 다양 한 불멸 하 게 셀 라인의 문화에서 높은 수확량을 가진 단백질의 생산을 위해 예정 되었다. 지속적으로 배양 세포 격실에 집중된 조절된 매체 (CM) 인 원하는 제품을 풍부 하 게 셀 수 있습니다. 이론적으로, 동일한 개념은 다양 한 세포 선에서 exosome 생산에 도움이 될 것 이라고 하 고 크게 exosome 수익률40증가 입증 되었다 실제로 생물 플라스 크에서이 세포를 배양. 큰 중간 저수지 지속적으로 영양분을 공급 하 고 셀, 접촉 되도록 중간 또는 일반의 큰 볼륨을 필요로 하지 않고 장기 문화를 허용 10 kDa 세미-투과 할 멤브레인 통해 셀 구획에서 폐기물을 제거 합니다. 전반적인 비용과 대규모 exosome 생산40의 노동 변화 플라스 크는 궁극적으로 저장할 수 있습니다. 그것은 또한 exosomes의 immunomodulatory 기능 뿐만 아니라 형태, 표현 형 절연 장기 생물 플라스 크 문화 비슷합니다 일반 75 c m2 플라스 크40에서 경작 하는 세포에서 공급 하는 세포를 시연 했다. 생물 플라스 크에서 exosome 소스로 다른 불멸 하 게 셀 라인의 문화 것 따라서 그들의 무결성과 기능을 유지 하면서 자신의 exosome 수율을 향상 도움이 됩니다. 그러나이 형태의 문화 제한 부문 주기와 1 차 셀에 적용 되지 않습니다을 수 없는 수 교양 높은 밀도 이다.

CM의 수확은 매주 수행 문화에 셀은 결코 passaged 때문에, 그것은 생물 플라스 크에 세포는 일반 세포 배양 같은 단층에 성장 하지 추측 될 수 있다. 그들은 가장 가능성이 괴 센터 클러스터 형성 또는 단순히 셀은 너무 confluent는 단층에 대 한 다이 고 표면에서 분리. 생물 플라스 크의 셀 구획의 육안 검사가이 가정을 확인 불가능 하지만 CM 수확 년도 죽은 세포의 많은 수에 의해 반영 된다. 제대로 부착 하 고 가능한 비 세포 생물 플라스 크에서의 정기적인 제거 가스, 영양분과 세포 구획 및 매체 간의 폐기물의 교환에 부정적인 영향을 줄 수 있는 반 투과성 막에 자료의 구축을 방지할 수 있습니다. 저수지, 되므로 장기 문화에 대 한 생물 플라스 크 > 6 개월40. 이러한 맥락에서 생물 플라스 크에 세포 성장의이 아닌 규칙은 이상적 우리가 추측 그것은 기존의 단층 세포 배양 보다 더 밀접 하 게 종양 성장에서 vivo에서 의 실제 상태를 모방 하 고 그것은 기대 하는 exosomes 암 생물 플라스 크에 세포 종양 vivo에서 분 비 하는 더 비슷한 것에 의해 제작. 이 특히 종양 병 리의 진행 성에 서 종양에서 파생 된 exosomes의 역할에 보고 하는 연구에 도움이 될 것 이다. 종양에서 파생 된 exosomes 기원32의 그들의 조직에 본질적으로 하 고 우선적으로 가정에 보고, 따라서 그들의 vivo에서 흉내 낸 시스템에서 생산 하는 exosomes 생산 또한 것 보고 연구에 마약 nanocarriers로 exosomes의 수동 타겟팅 기능을 탐색합니다.

P:P 비율에서 exosomes41에서 공급 된 생리 적 체액의 문화 매체에서 단백질 오염에서 분리 된 exosomes의 순수성 평가를 매개로 보고 되었다. 8.3 ± 1.7 × 1010 p / µ g이이 연구에서 얻은 P:P 비율 범위 내에서 고 순도 연구에서 제안 된 폭포. 이 비율은 단백질 농도 표현를 사용 수확량 또는 절연 또는 사용 다운스트림 연구에 각각,이 exosomes 단백질의 문제를 주어진 샘플에서 사용할 수 있는 실제 금액을 반영 하지 않는다 exosomes의 복용량의 위험을 강조 격리 하는 동안 오염입니다. Exosomes 입자 수 농도 측정, NanoSight 등 악기를 통해 NTA exosomes 측정의 더 합리적이 고 정확한 방법입니다.

정확한 무게 중수소 산화물에서 25% 자당 해결책의 준비 동안이 방법은 밀도 기반 격리로 결정적 이다. Exosomes 범위가 다소 좁은 부유 밀도의 자당 솔루션에 자당 쿠션의 정확한 준비 격리42동안 apoptotic 시체 같은 비 exosomal 소포 또는 소포 Golgi 파생의 오염을 감소 시킬 것 이다 그래서. 그것은 튜브에 공기의 응축 또는 증발에 의해 손실 등의 밀도 변경할 수 있는 요인의 위험 또는 추가 솔루션에 물의 피하기 위해 1 일 후에 사용 하 고 남은 자당 솔루션 지키려고 하지 좋습니다. 스윙 아웃으로 터의 사용 자당 솔루션에도 마이그레이션 exosomes의 CM에서 있도록 자당 쿠션에 원심 분리 동안 필수입니다.

자당 솔루션 후 원심 철수 섬세 한 단계 이며 또한 그것은 복구 된, 그리고 너무 많은 문화 매체에서 단백질 철회 exosome 샘플을 소개 하는 exosomes의 양을 극대화 사이 타협을 찾는 포함 . 자당 솔루션 및 조건 매체 간의 인터페이스 이며 어디 문화 매체에서 단백질 후 원심 분리, 수집 하는 것 일반적으로 어두운 갈색 링 인터페이스에 앉아 볼 수 있습니다. 우리의 손에서 추가 초기 3 mL에서 자당 쿠션의 2 개 mL를 철수은 위에서 언급 한 타협을 동의 최적의 볼륨입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 볼륨은 특정로 터 사용; 따라서, 위로 또는 아래로 다른 시설에서 사용할 수 있는 터의 종류에 대 한 볼륨을 확장 하는 때 철회 하는 자당의 볼륨을 최적화 하는 것이 좋습니다. 그것은 또한 미색 펠 릿으로 볼 수는 자당이 자당 보다는 더 높은 조밀도의 입자 앙금을 것 이며 일반적으로 수로 철수 하는 때 튜브의 하단 중앙에 지역 권리를 피하기 위해 중요 한.

상대적으로 많은 양의 PBS로 세척 단계 더 exosome 격리41동안 단백질 오염 정도 줄이기 위해 도움이 됩니다. 이 단계 또한 자체 또는 exosomal 루멘 내의 생체는 exosomes 삼 투 손상을 방지 하기 위하여 exosomes에서 초과 자당을 제거 세균 및 곰 팡이 성장 exosome 재고의 위험을 감소에 필수적 이다. 삼투성 손상 및 미생물 오염 위험을 줄이고 따라서 물 격리 exosome 부유 밀도 달성 하는 데 필요한 자당의 양을 줄일 하는 데 도움이 보다는 중수소 산화물에서 자당 솔루션을 준비. 자당 쿠션, exosome 포함 된에 첫 번째 원심 분리 후 자당 레이어 철회 하 고 PBS에 추가 4 ° C에 저장 하 고 시간 제약에 직면 하는 경우는 다음 날 처리 수 있습니다.

우리의 지식 최선을 exosome/siRNA 어 금 니 비율은 electroporation의 효율성 결정에 있는 중요 한 요소 이다. 이 프로토콜에서 우리는 siRNA 어 금 니 비율 exosome로 1:60를 사용. Exosomes의 다른 종류의 캡슐화 능력은 다른, 우리가 좋습니다이 사건에-의해-사건을 기준 최적화. 그러나, 여기에 제안 된 캡슐화 효율 항상 최적의 electroporation 조건 선택 하기 위한 매개 변수 수입니다.

또한, siRNA의 aggregation electroporation에 가장 일반적인 문제 중 하나가 될 여겨진다. 그것은 입증 그 electroporation exosomes 입력을 더욱 만드는 siRNA의 강한 집계를 일으킬 수 있다. siRNA 집계는 종종 실수로 exosome 따라서 적절 한 컨트롤로 캡슐화 siRNA의 siRNA의 형성은 electroporation28동안 피할 수이 연구에 사용 되었다로 해석 됩니다. 우리의 정화 방법의 비율 캡슐화 효율 배경 잡음, exosome 및 siRNA 집계 데이터의 신뢰성에 영향을 미칠 것 이라고 하는 같은 다른 소스에서 영향을 최소화 하기 위해 정규화 된 값을 사용 하 여 계산 됩니다. 우리의 연구 결과 바탕으로, 무시할 siRNA 집계는 컨트롤 샘플 즉, electroporated 및 유엔 electroporated siRNA를 사용 하 여에서 관찰 했다.

이 프로토콜은 성공적으로 exosomes로 siRNA의 캡슐화를 설명 하 고 암에는 siRNA의 그들의 연속적인 세포내 전달 세포 에 생체 외. 따라서, 다양 한 종류의 다른 세포에서 exosomes 수 절연 및 특징 제안 된 프로토콜을 사용 하 고 이후에 다른 암에-표현 종양 대상의 종류에 대 한 다양 한 치료 siRNA와 로드. 응용은 exosome 소스 대상 셀 쌍 체 외의 다양 한 순열을 사용 하 여 siRNA 전달 및 통풍 관 효율을 탐구 하는 것입니다. 이 다음 모두 배달의 효율성 및 siRNA 캡슐화 exosomes의 치료 효율을 평가 하기 위해 동물 모델에 번역 될 수 있다 vivo에서.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

F. N. Faruqu 집회 Amanah Rakyat (마라) 말레이시아 정부 기관에 의해 자금입니다. L. 쑤 마리 퀴리 Sklodowska 개별 동호회 (Horizon 2020) (H2020-MSCA-IF-2016) 받는 사람입니다. K. T. 알-자 말 BBSRC (BB/J008656/1) 및 Wellcome 트러스트 (WT103913)에서 자금을 인정 합니다. 저자 또한 박사 폴 라벤더와 박사 데이비드 두려움 (부의 호흡과 알레르기, 왕의 대학 런던)는 electroporator을 제공 하는 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Material
Sterile Newborn Calf Serum Heat Inactivated First Link 08-05-850 500 ml
EMEM medium Thermo Fisher Scientific 11090081 500 ml
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140-122 100 ml
GlutaMax Thermo Fisher Scientific 35050-038 100 ml
Sucrose Fisher Scientific S/8600/60 1 kg
Deuterium oxide (D2O) Sigma-Aldrich 151882 250 g
1X Phosphate Buffered Saline  Thermo Fisher Scientific 10010015 500 ml
Glycine VWR Chemicals 101196X 1 kg
Sepharose CL-2B GE Healthcare Life Sciences 17-0140-01 1 L; Particle Size 60 μm-200 μm
Trypsin-EDTA 0.05% Thermo Fisher Scientific 25300096 100 ml
Aldehyde/sulfate latex beads Thermo Fisher Scientific A37304 4% w/v, 4 µm, 15 ml
MicroBCA kit Thermo Fisher Scientific 23235
CD81 antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-0819-42 Lot: E15950-104. RRID: AB_11150235. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD81 isotype (APC) Thermo Fisher Scientific 17-4714-81  Lot: 4291563. RRID: AB_763650. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 antibody (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-0098-41 Lot: 4345870. RRID: AB_10698007. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD9 isotype (FITC) Thermo Fisher Scientific 11-4714-41 Lot: 4299784. RRID: AB_10598647. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 antibody (PE) Thermo Fisher Scientific 12-0639-41 Lot: 1930435. RRID: AB_2572564. 1:10 dilution in 50 µl sample
CD63 isotype (PE) Thermo Fisher Scientific 12-4714-81 Lot: 1937696. RRID: AB_470059. 1:10 dilution in 50 µl sample
Atto655-siRNA Eurogentec     SQ-SIRNA (Labelled-S) UGC-GCU-ACG-AUC-GAC-GAU-G55; (Unlabelled-AS) CAU-CGU-CGA-UCG-UAG-CGC-A55.
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Millex-GP Syringe Filter Unit 0.22 µm Millipore SLGP033RS
CELLine AD1000 bioreactor flasks Wheaton WCL1000ad
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-80
Swing-out rotor Beckman Coulter SW45 Ti
Fixed-angle rotor Beckman Coulter Type 70 Ti
Ultracentrifuge tubes Beckman Coulter 355631 Polycarbonate. Max. fill 32 ml
Ultracentrifuge bottles Beckman Coulter 355618 Polycarbonate. Min. fill 16 ml, max. fill 25 ml
NanoSight Malvern LM10 Software: NanoSight NTA v3.2
Flow Cytometer BD Biosciences FACSCalibur
Centrifuge Eppendorf 5810R
Plate reader BMG Labtech FLUOstar Omega
Flow cytometry tubes BD Biosciences, Falcon 352052
Microfuge tubes Starlab S1615-5500 1.5 ml
Cell culture flasks Fisher Scientific 156499 75 cm2
Transmission electron microscope FEI Electron Optics Philips CM 12 with Tungsten filament and a Veleta – 2k × 2k side-mounted TEM CCD Camera (Olympus, Japan)
Amaxa Nucleofector I Lonza Nucleofector I with Amaxa’s Nucleofector Kits
24-well flat-bottom plates Corning Costar
Blunt fill needle BD Biosciences 305180 18G x 1 1/2" (1.2 mm x 40 mm)
Glass pipettes Fisher Scientific 1156-6963
Name Company Catalog Number Comments
Reagents Composition
Normal medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted medium Eagle's Minimum Essential Medium supplemented with 10% exosome-depleted FBS (see below), 1% penicillin/streptomycin and 1% GlutaMax.
Exosome-depleted FBS Subject FBS to ultracentrifugation at 100,000 g for 18 h at 4°C. The FBS supernatant post-centrifugation was collected and sterile-filtered using 0.22 µm filters.
25% w/w sucrose cushion Add 1.9 g (± 0.001 g) of sucrose in a universal tube, and top up with D2O until the weight reaches 7.6 g (± 0.001 g). This makes ~6ml of the 25% w/w sucrose cushion.
3% FBS/PBS Add 1.5 ml exosome-depleted FBS to 48.5 ml 1X PBS to prepare 50 ml of 3% FBS/PBS.
100 µM BSA solution Prepare 1mM BSA solution by adding 0.3325 g to 50 ml PBS. Make 1:10 dilution of this stock to obtain 100 µM BSA solution. Make 5-10 µl aliqouts of this 100 µM BSA solution (for single use) and store them at -20°C. All BSA solution should be stored at -20°C, and discard solutions that have undergone ≥2 freeze-thaw cycles.
100 mM glycine solution Add 0.375 g of glycine to 50 ml PBS to obtain 100 mM glycine solution, store at 4°C.
Citric acid buffer with EDTA Mix 0.1954 g citric acid and 0.2087 g disodium phosphate in 50 mL of deionised water. Add EDTA to 0.1 mM. Adjust pH to 4.4.
Fixing solution Prepare formaldehyde/glutaraldehyde, 2.5% (w/v) each in 0.1 M sodium cacodylate buffer, and adjust pH to 7.4.
Aqueous uranyl acetate Prepare 25% (v/v) uranyl acetate in methanol.
50% methanol/H2O Mix methanol and H2O 1:1 (v/v).
SEC Column packed with Sepharose CL-2B Dilute 37.5 ml Sepharose CL-2B resin with 12.5 ml PBS to obtain 75% Sepharose CL-2B solution. Pour the Sepharose CL-2B solution into a column of dimension 2.9 cm [H] x 1.3 cm [W]. Pour the Sepharose CL-2B to 3-4 mm above the stated height, and then press it down to the stated height with the filter for optimal packing.
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Faruqu, F. N., Xu, L., Al-Jamal, K. T. Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells. J. Vis. Exp. (142), e58814, doi:10.3791/58814 (2018).
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