がん細胞への siRNA のエクソソームの準備

1. 細胞の培養バイオリアクターのフラスコ 図 1: 細胞エキソソーム生産用バイオリアクター フラスコの内培養。(A) バイオリアクター フラスコの解剖学を簡略化します。(B) の開始は、バイオリアクター フラスコの文化します。通常とエキソソーム枯渇中エアコン (C) 収穫中 (CM) の組成や培養バイオリアクターのフラスコのメンテナンスのため材料の表を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 通常の培地で HEK 293 細胞の培養 (資料の表を参照してください。5% CO2、37 ° C) (90% 合流) まで 4 x T75 フラスコに展開しています。 バイオリアクターのフラスコの中の貯水池に通常媒体の 50-100 mL を追加して膜バイオリアクター フラスコを濡れています。 コート t75 フラスコと再懸濁します x 4 からすべて HEK 293 細胞を収集エキソソーム枯渇中の 15 mL のそれら (材料の表を参照してください)。 鈍塗りつぶしに接続して 20 mL シリンジを用いたバイオリアクター フラスコの細胞コンパートメントに HEK 293 細胞懸濁液を追加 (材料の表を参照) を形成している可能性がありますすべてのバブルを削除する注意して針。 いっぱいバイオリアクターのフラスコの中の貯水池通常培地で 500 mL とインキュベーター (5% CO2、37 ° C) でフラスコに 1 週間。 2. 馴化培地 (CM) バイオリアクター フラスコから収穫 1 週間後、バイオリアクターのフラスコの中の貯留層内のすべてのメディアを破棄します。 すべてのメディアを取り出して細胞コンパートメント (すなわち、 CM) 20 mL の注射器を使用して鈍塗り針に接続しています。 中規模のリザーバーに通常媒体の 50-100 mL を追加します。 古いメディアを削除し追加新鮮なエキソソーム枯渇中鈍い塗り針に接続して 20 mL の注射器を使用して電池コンパートメントにエキソソーム枯渇中の 15 mL を追加します。 いっぱいバイオリアクターのフラスコの中の貯水池通常培地で 500 mL とインキュベーター (5% CO2、37 ° C) でフラスコをもう一週間。注: 1 年以上の文化を継続できます。2.2 のステップの最初の収穫から CM エキソソーム分離され、破棄されます。2ndとその後の収穫は、CM はエキソソーム分離保持します。 3. エキソソーム ショ糖クッションに分離 図 2: エクソソームの分離と性状。(A) 事前清算収穫馴化培地 (CM) 死んだ細胞や細胞の残骸から。(B) ショ糖クッションに CM からエクソソームを分離します。(C) ショ糖と汚染タンパク質を削除するステップを洗浄します。(D) 分離エクソソーム、物理化学的、生化学的、形態学的評価を受けた。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 とおり差動遠心分離と濾過によって (手順 2.2) から CM をクリア済み。 500 x g で 4 ° C で 5 分間遠心上清を新しいチューブに転送し、ペレットを破棄します。上清を回復して、ペレットを破棄この遠心分離手順をもう一度繰り返します。 ステップ 3.1.1 2,000 x g は 15 分、4 ° C から上清を遠心し、ペレットを破棄します。0.22 μ m のフィルターを通して回復培養上清中一度をフィルターします。 前洗浄中に、1.9 g (± 0.001 g) 普遍的なチューブでショ糖のうち正確に計量し、重水素酸化物トッピング、重量 7.6 g (± 0.001 g) に達するまで重水素酸化物の 25% (w/w) のショ糖液を準備します。 いっぱいなの遠心チューブ (材料の表を参照) を 0.22 μ m フィルターで 22.5 mL CM cm 作る事前認可の 22.5 ml PBS の場合は現在の量がより少ない。 ガラス管にピペットの (材料の表を参照してください) と、それを通して、ショ糖溶液 3 mL を追加するソリューションが CM の下に独立した層を形成できるように場所です。 慎重にチューブを含む場所はスイング アウト ローターのバケットに CM/ショ糖液を層 (材料の表を参照)、ロータにバケツを確保。 超遠心機にローターを配置 (材料の表を参照してください)、4 ° C で 1.5 h の 100,000 × g でスピン ショ糖層 2 mL を収集し、遠心ボトルにこれを追加 (材料表参照) フィルターの 20 mL を含む PBS 洗浄工程。 固定角ローターにチューブを配置 (材料の表を参照してください)、4 ° C で 1.5 h の 100,000 × g でスピン 慎重に 10 mL の血清ピペットで上澄みを除去し、400 μ L フィルター PBS でペレットを再懸濁します。それぞれ、4 ° C または-80 ° C、短期または長期の記憶でこのエキソソーム株式を維持します。 4. エキソソーム サイズおよび追跡分析 (NTA) ナノ粒子による収量の評価 確認 1:1, 000 1:50、国税庁の表示フレームで 20-80 粒子を受けましたら 1 mL (最小 750 μ L) ボリュームでエキソソーム株式 000 希釈計測 (材料の表を参照) を表示します。 1 mL の注射器を使用して国税庁楽器サンプル室に希薄エキソソーム株式を挿入して温度プローブ入口温度計の温度プローブを挿入します。 NTA ソフトウェアを設定 (材料の表を参照) 次のように記録するため: 3 つの標準的な測定は、30 s、それぞれ手動温度オプションをオフ;[詳細設定] タブの下で希釈倍率を入力します。 カメラのレベルを 13 に設定し、国税庁ソフトウェア、サンプルの新鮮なバッチを注入して各読んだ後メッセージが表示されたら、サンプル室の温度を入力キャプチャ スクリプトを実行します。 4 その後の分析の部分のためにしきい値を設定し、平均モーダル サイズおよび粒子濃度測定からエキソソーム在庫に注意してください。 5. 粒子: タンパク質比測定によってエキソソーム純度の評価 ビシンコニン酸 (BCA) タンパク質アッセイによるエキソソーム株式のたんぱくキット (材料表参照) 次のように測定します。 準備、基準を定義します。 微量遠心チューブに BSA 原液 (2 mg/mL-アッセイ キットで提供される) の 45 μ L を追加することによって高い濃度 (500 μ g/mL) の標準を準備、PBS で最大 180 μ L です。 8 マイクロ遠心チューブ用を 90 μ L の PBS に詰めます。 シリアルの希薄を作る (要因: 0.5) PBS (混ぜる) と管の標準的な最高の BSA から 90 μ L を取って、1st遠心にこれを追加することによって、このチューブから 90 μ L を撮影し、2nd遠心管にそれを追加します。 7 遠心チューブまでこの手順を繰り返します。8 チューブだけ PBS になります (すなわち空白: 0 μ g/mL)。 (サンプルの 45 μ L、45 μ L の PBS) 90 μ L の総ボリュームで PBS でサンプルの 1:2 希釈することによってエキソソーム サンプルを準備します。 BCA 試薬ミックスの作業を準備します。 BCA 試薬ミックス必要 (50 μ L/ウェル、重複、基準を含む) の作業の合計量を計算します。 以下の比率に応じて個々 の BCA 試薬を混ぜる: 25 パーツ試薬 a: 24 パーツ試薬 b: 1 部分試薬 c. 測定と分析を実行します。 (それぞれの標準およびサンプルの重複) 96 ウェル プレートのウェルに上記準備各標準とエキソソームのサンプルの 40 μ L を追加します。注: これは、比色定量法は、適切なピペッティング テクニックは正確な結果を達成するために非常に重要です。井戸のそれぞれに各標準/サンプルの複製を追加後にピペットを変更します。 各ウェルに試薬ミックスを働く蛋白質の試金の 50 μ l 添加し 37 ° C、30 分でプレートを孵化させなさい。注: 複製間のばらつきを最小限に抑えるために標準/サンプルの 1st複製にタンパク質アッセイ働き試薬を追加 1stにそれを追加する前に、同じサンプル/標準の 2ndの複製が続く別のサンプル/標準を複製します。 562 で吸光度を測定プレート リーダーの nm (材料の表を参照してください)。 規格の吸光度の値から標準曲線をプロットし、曲線の方程式を使用して各サンプルの蛋白質の集中のエクササイズします。 粒子: タンパク質比を計算する上で測定されますエキソソーム株式のタンパク濃度おいたエキソソーム収量を割る。 6. フローサイトメトリーによる Exosomal マーカー発現の解析 (ストックから原液) アルデヒド/硫酸ラテックス ビーズの 10 μ L で 40 μ L エクソソーム (≥1×1011粒子/mL) の室温 (RT) で 15 分間インキュベートします。 100 μ M BSA 溶液 5 μ L を追加 (材料の表を参照) を 10 mM の最終濃度を達成し、室温 15 分間インキュベート エキソソーム ビーズ混合物に PBS の 1 mL を追加し、ロッキング シェーカー (~ 150 rpm) で軽度の動揺と微量遠心チューブに RT で 75 分間インキュベートします。 RT で 5 分間 580 x グラムの懸濁液を遠心分離し、上澄みを廃棄します。 100 mM グリシン溶液 1 mL にペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)、室温 30 分間インキュベート 580 x g. 破棄で 5 分間懸濁液上清を遠心し、3% の 1 mL にペレットを再懸濁します FBS/PBS (材料の表を参照してください)。 この洗浄工程を繰り返し、3% の 350 μ L でペレットを再懸濁します FBS/PBS。 懸濁液 50 μ L を含む各 7 管に懸濁液を分割し、蛍光標識抗 CD81、アンチ CD9 とアンチ CD63 抗体および対応するアイソタイプ コントロールでそれらを孵化させなさい (1:10 希釈)、それぞれ、4 ° C で 45 分無染色のコントロールが同じ処理を受ける管の 1 を保ちます。 3 s/PBS 各チューブ、580 x g で 5 分間遠心し、上澄みを廃棄の 1 mL を追加します。 3% の 200-400 μ L でペレットを再懸濁します FBS/PBS および流れの cytometer のサンプルを分析 (材料表参照) 適切なチャネルの下で。 7 透過電子顕微鏡 (TEM) によるエキソソーム形態の特性 1010 p/mL のソリューションを修正など適切な濃度でエキソソームの水性分散液を修正 (材料の表を参照) で 15 分。 300 サンプル メッシュ カーボン コートの場所はグリッドを銅、空気に残して乾燥。 マイナス 0.22 μ m フィルター水溶液ウラニル酢酸試料を染色 (材料表参照) 2 50% メタノール/H2O に続いて 4 分間洗う (材料の表を参照してください)。 空気は、試料を乾燥します。 電子顕微鏡下で試料を観察 (材料の表を参照してください)。80 で加速電圧をセット kV とスポット サイズ 2 で。すべてのサンプルと対物絞りを使用します。 8. siRNA エレクトロポレーション エクソソームにカプセル化 エレクトロポレーション キュベットをあらかじめ冷やす (材料表参照) エレクトロポレーションの前に 30 分間氷の上。 遠心チューブの siRNA (RNase フリー水入荷 2 μ M から 12 μ L) の 0.33 μ g とエクソソーム (7 x 1012 p/mL PBS 入荷から 32 μ L) のミックス 7.0 μ。クエン酸バッファー 150 μ L にボリュームを構成する (材料の表を参照してください)。エキソソーム siRNA モル比は 1: 60 この場合です。 エレクトロポレーション キュベットに混合物を転送します。キュベットをキャップし、本体のキュベット ホルダーに配置 (材料の表を参照してください)。回転ホイール 180 ° 時計回りに回転させます。注: ホイールは、キュベット電極に接触するためには、ロックの位置を完全にする必要があります。 目的エレクトロポレーション プログラムを選択 (例えば、 X-01、X-05、A-20、T-20, T-30、等) し開始ボタンを押すとエレクトロポレーションを開始。注: 成功したパルスは、ディスプレイに”OK”を示すことによって示されます。 一度 electroporated、反時計回りにホイール 180 ° を後戻り後キュヴェットを削除します。さらなる処理のためプラスチック製のピペットとキュベットからサンプルを撤回します。 9. 無料 siRNA によるサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) の除去 秒コラムを平衡させ (2.9 cm [H] × 1.3 cm [W];材料表を参照ください) フィルター処理された PBS の 3.5 mL を 2 回渡すことによって。 350 μ L フィルター処理された PBS ので electroporated サンプルの 150 μ L に溶解し、これを無料 siRNA 除去を実行する秒列に転送します。 列 (F0) から溶出最初 500 μ L の分数を収集します。 列にフィルターが適用された PBS の 500 μ L を追加し、次の 500 μ L の割合 (F1) を収集します。 10 x 500 μ L 分画 (F9) までの合計が収集されるまでは、上記の手順を繰り返します。F1 と F2 は、siRNA カプセル エクソソームを含める必要があります。 フィルター処理された PBS を洗い流す (2 回、少なくとも) サンプルの任意の残基を削除します。 10. panc-1 細胞への siRNA ロード エクソソームのin Vitro取り込み 取り込み前にも 24 h あたり 50,000 セルの密度で 24 ウェル平底プレート (材料の表を参照) でシード panc-1 細胞研究し、インキュベーター (5% CO2、37 ° C) で細胞を孵化させなさい。 Atto655 siRNA と Electroporate HEK 293 エクソソーム (7.0 μ g) (0.33 μ g)手順 8に従って。 手順 9に従って electroporated エキソソームを浄化し、100 μ L の PBS に再懸濁します。 PANC-1 セルに electroporated エクソソームの 50 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2 4 時間インキュベートします。 培養後、細胞を収集します。 1 ml 滅菌 PBS のセルを洗浄し、ポリスチレンの丸底で PBS の 200 μ L で再懸濁しますチューブ (材料の表を参照してください)。 フローサイト メーターによる細胞を分析 (材料表参照) サンプルごと買収した 10,000 のイベント。注: 国連 electroporated エキソソーム siRNA 混合試料とフィルター処理された PBS で未処理のセルは、コントロールとして使用されました。