近一代测序鉴定小鼠与人体抗体的分泌

所有动物实验都是根据机构准则并经国家传染病研究所动物护理和使用委员会批准进行的。本报告作为代表结果, 对健康的成年志愿者进行了多溴联苯并溴调查科联用抽样, 得到了日本东京国家传染病研究所道德委员会的批准, 并获得了书面知情同意使用道德操守委员会批准的表格的每个参与者。 1. 底漆设计 设计了一种通用的 cdna 正向引物, 用于扩增免疫球蛋白mrna, 而不受 pcr 引物的影响, 如 5 ‘-race 11、12和 sart-pcr13技术所示。 对于免疫球蛋白 vh 基因扩增, 设计恒定区域内的免疫球蛋白类特异性序列作为反向引物8,14 (图 1 a)。注: 可以在这些引物中添加多重标记序列, 以标记来自不同样品源的库分子。根据使用的试剂盒手册, 还可以添加嵌套 PCR 的序列 15。 通用正向底漆 5 ‘-AGGGGGTAGCATGAGGT-3 ‘ 小鼠免疫球蛋白的反向引物 (Ref.8) IgM_CH1: 5 ‘-CACATGATTTACAGGGGGCTCTCTCT-3 ‘ IgG1_CH1: 5 ‘-CATCCACCAGGGGGGGGTTAGTGG-3 ‘ IgG2c_CH1: 5 ‘-GTACCCCACCCACCAGGGCAGGGGGGGGGGGGGGGGGGA-3 ‘ IgG3_CH1: 5 ‘-ATGGCACCCCCGCGGGGGGGGGA-3 ‘ IgA_CH1: 5 ‘-加塔加加加加加加加加加加-3 ‘ Ig _ CH1: 5 ‘-GCCTCTGGGGGGGGGGGGGGGGAGATACAGG-3 ‘ Ig _ CH1: 5 ‘-CTBGAGCTCAGGGGGGGGAACA-3 ‘ 人类免疫球蛋白的反向引物 (ref. 14) IgM_CH1: 5 ‘-GGAATCTCACCAGAGAGGG-3 ‘ IgG_CH1: 5 ‘-AAGCCAGGGCCCTGG-3 ‘ IgD_CH1: 5 ‘-GGGGGGTGCCCCTGATA-3 ‘ IgA_CH1: 5 ‘-GAAGACTGGGGCTGGGGGT-3 ‘ IgE1_CH1: 5 ‘-GAGAGGGGGCTGT-3 ‘ IgE2_CH1: 5 ‘-TTGCAGGGGGGGGGCAAGGG-3 ‘ Ig _ CH1: 5 ‘-TGCATACGATGGGGGGGGATT-3 ‘ Ig _ CH1: 5 ‘-AGAGGGGGGGGGGAGGGGGGA-3 ‘ 表 1: 免疫球蛋白的 pcr 扩增入门序列 2. 从免疫细胞和组织中分离核酸 注: 下面给出的程序是从小鼠脾脏中提取核酸。然而, 它适用于其他免疫组织和人体细胞, 如淋巴结或外周血单个核细胞 (Pbmc) (图 1 b)。 解剖组织,例如, 从8周的 c57bl6 小鼠的脾脏, 并通过不锈钢网 (200 至 400μm) 与2毫升的 pbs 缓冲液, 以获得分散的细胞。将细胞悬浮液转移到 2.0 mL 微离心管中, 并在600xg 和4°C 下离心 5分钟。放弃上清液。 加入800Μl 的 ACK 裂解缓冲液 (150 mM NH4 cl,1 MM khco 3, 0.1mm na 2 edta,ph 7.2), 在冰上孵育 2分钟, 以裂解组织中的红血球。 用 PBS 3x 的2毫升清洗组织细胞, 然后在 600xg和4°c 离心5分钟。 在颗粒中加入800Μl 的苯硫代鸟酸异硫氰酸试剂, 彻底涡流, 在25°c 左右孵育5分钟。 加入氯仿 (200μl), 手动晃动 15秒, 然后在25°c 左右孵育2分钟。 在 12, 000xg 和25°c 的温度下离心 15分钟分离相, 并将上水相转移到新鲜的管中。 加入一体积70% 乙醇, 旋涡短暂, 并将其应用于二氧化硅自旋柱。 用30–100μl 的水使 RNA 被洗脱。 使用荧光计 (材料表) 定量初始 rna 浓度。 将纯化后的 RNA 存放在-80°C。 3. cDNA 合成与 PCR 扩增 注: 下面描述的方法基于 5 ‘-race11、12和 smat-pcr 技术13。试剂盒15的手册中描述了反应的细节和优化. 小鼠免疫球蛋白的起始材料是第2.10 步的样本。人体免疫球蛋白的起始材料是人体组织的样本, 如步骤2.3 至2.10 所述。 根据制造商的说明 15, 使用 5 ‘-race CDNA 底漆 (含寡核苷酸) 和 s高温-pcr 寡核苷酸 (材料表) 合成2至10μg 的总 rna 模板的第一链 cdna。 对于小鼠免疫球蛋白, pcr 使用通用正向引物和免疫球蛋白类特异性反向引物, 用高保真 dna 聚合酶扩增 cDNA (表 1)。将热循环条件设置为: 94°c 2分钟, 然后40个周期 94°c, 59°c 30秒, 72°c 30秒, 最后延长 72°c 5分钟。注: 典型的实验放大 IgM、IgG1、IgG2c、Igk 和 Igl 免疫球蛋白类, 以观察天真的、Th1 依赖的 b 细胞和 Th2 依赖 b 细胞 (图 3)。 对于人体免疫球蛋白, 使用通用正向引物和免疫球蛋白类特异性反向引物 (表 1) 进行第一次pcr, 并带有标记序列。用索引序列引物通过第二次 pcr 包括每个样本的索引序列.使用以下 PCR 条件和 Taq 聚合酶: 94°c 2分秒, 21周 (1 pcr) 或32个周期 (2nd pcr) 在 94°c, 59°c 30秒, 72°c 30秒.注: 典型的实验放大 IgM、IgD、IgG (IgG1、Igg2、IgG3 和 IgG4)、Iga (IgA1 和 IgA2)、IgE、Igk 和 Igl 免疫球蛋白类, 以观察所有 B 细胞群 (图 4)。 在琼脂糖凝胶上电泳 PCR 产物, 并使用硅膜自旋柱纯化600至 800 bp 碎片。 在2% 琼脂糖凝胶上对3.2.1 或3.2.2 的样品进行电泳。 可视化 uv 透射光器上的 DNA 带, 并对含有600至 800 bp 宽带的胶片进行切除。 每10毫克凝胶片加入10毫升膜结合溶液。在50–65°c 下混合和孵育, 直到凝胶片完全溶解。 将凝胶溶液转移到硅膜自旋柱上。用洗涤缓冲液清洗一次, 用50毫升的无核水 (材料表) 洗一次。 用每个免疫球蛋白类别的荧光计和池振幅对纯化的振幅进行定量, 以进行相同数量的 NGS 测序。注: 通常情况下, 每个免疫球蛋白类别恢复2-10 毫克放大 dna。将每个样品溶液在 DNA 中均匀混合, 产生含有 10-20 ng dna/ml 的50毫升溶液。 使用基于微毛细管的电泳和 DNA 施胶芯片 (材料表) 确定文库的大小和浓度。将库存储在-20°c。 4. 图书馆的 NGS 测序 为指定示例名称、索引信息并指示仅获取. fastq 文件的排序运行生成 sampleshet. cvs。 解冻试剂盒 (材料表) 和库。 使 0.2 N NaOH 和稀释的文库, 以获得所需的摩尔浓度。 冲洗并干燥流动细胞。在试剂盒的井中加入600毫升稀释和变性的库溶液。 启动排序运行。 5. NGS 数据的质量控制 使用 “fastx 工具包”16执行 fastq 数据的质量控制。注: 所使用的参数设置的一个基本示例如下所示:fastq _ 质量 _ 微调器-v-t 20l-200-i [infilenamei. fastq]-o [infilenamei. fastq]fastq _ 质量 _ filcp-v-q 20-p 80-i [infilenamei. fastq]-o [infilenamei. fastq]fastx _ 反向 _ 补长-v-i [infilenamey. fastx]-o [infilenamey. fastx] 通过以下命令将输出文件格式化为 “紧固核酸 (. fna)”:fastq _ to _ fastq-v-n-i [infilenamei. fastq]-o [infilename. fna] 6. 从. Fna 数据中提取和分析免疫球蛋白序列 注: 示例程序是在 UNIX 环境中实现的。请将它们用作示例引用, 因为性能可能取决于操作系统和硬件环境。作者对错误或遗漏不承担任何责任。编程语言 perl 17、r18 和所需模块需要按照所引用网站上的说明安装。igblast 程序需要按照相应网站19、20 上的说明进行安装。 下载以下内部程序的例子, 以便从 https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine 进行剧目分析:03_PipeLine_Mouse.zip;一组用于分析小鼠抗体序列的示例程序。05_PipeLine_Human.zip;一组用于分析人类抗体序列的示例程序。 提取序列数据中的抗体读数: 通过搜索每个免疫球蛋白常量区域中的特征序列的 Perl 程序从数据 (. fna) 中提取每个 ig 类的免疫球蛋白 (Ig) 序列 (表 2)。 对于小鼠免疫球蛋白重链 (IgH) 基因, 通过以下命令提取读数:$perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [输入文件名] [输出文件名 (后缀)] 对于小鼠免疫球蛋白光链 (IgL) 基因提取读取由以下命令:$perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [输入文件名] [输出文件名 (后缀)] 对于人类免疫球蛋白重链 (IgH) 基因, 通过以下命令提取读数:$perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [输入文件名] [输出文件名 (后缀)] 对于人类免疫球蛋白光链 (IgL) 基因, 通过以下命令提取读数:$perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [输入文件名] [输出文件名 (后缀)] 对 V (D) J 基因重组的产能进行注释和检查:注: 下面描述的方法使用独立的 IgBLAST19来注释序列中的 V (D) j 基因片段。设置 V (D) J 基因的数据库和 IgBLAST 的参数设置, 如所述20。 通过以下命令对小鼠免疫球蛋白重链 (IgH) 基因进行注释:$igblastn _ db _ V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline _ db _ j $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline _ db _ d $IGDATA-生物体-域 _ system imgt 查询./$InFile 辅助 _ data $IGDATA/opitalfile/鼠标 _ glt. aux-show _ pect-outfmt 7 > >./$OutName 通过以下命令对小鼠免疫球蛋白光链 (IgL) 基因进行注释:$igblastn _ db _ V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline _ db _ j $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline _ db _ d $IGDATA-生物体-域 _ system imgt 查询./$InFile 辅助 _ data $IGDATA/opitalfile/鼠标 _ glt. aux-show _ pect-outfmt 7 > >./$OutName 通过以下命令对人体免疫球蛋白重链 (IgH) 基因进行注释:$igblastn _ Db _ v $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline _ db _ j $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline _ db _ d $IGDATA 生物体人域-域 _ system imgt 查询./$InFile 辅助 _ data $IGDATA/opentalFile/人类 _ glo. aux-show _ p发 ic-outfmt 7 > >./$OutName 通过以下命令对人体免疫球蛋白光链 (IgL) 基因进行注释:$igblastn _ Db _ v $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline _ db _ j $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline _ db _ d $IGDATA 生物体人域-域 _ system imgt 查询./$InFile 辅助 _ data $IGDATA/opentalfile/man _ glo. aux-show _ p发 ic-outfmt 7 > >./$OutName 可视化抗体曲目的全球特征。 通过以下命令可视化鼠标 IgH 曲目:$ .00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh注: 输入文件是文件名. fna (序列数据), 最好是从6.2.1 的输出文件。此文件需要放置在名为 “文件名” 的较低目录 (文件夹) 中。在 shell 脚本的第50行中, 为 Para_4 指定一个 “文件名”。 通过以下命令可视化人类 IgH 曲目:$ .00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh注: 输入文件是文件名. fna 序列数据, 最好是6.2.3 的输出文件。此文件需要放置在名称为 “文件名” 的较低目录 (文件夹) 中。在 shell 脚本的第46行中, 为 Para_4 指定一个 “文件名”。 通过以下命令可视化鼠标 IgL 曲目:$ .00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh注: 使用此管道, Igk 和 Igl 将同时进行处理。输入文件是文件名. fna (序列数据), 最好是来自6.2.2 的输出文件。此文件需要放置在名为 “文件名” 的较低目录 (文件夹) 中。在 shell 脚本的第53行中, 为 Para_4 指定一个 “文件名”。输出文件的名称, 以 “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” 结尾, 给出二维条形图的坐标 (图 3, igl)。 通过以下命令可视化人类 IgL 曲目:$ .00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh注: 使用此管道, Igk 和 Igl 将同时进行处理。输入文件是文件名. fna 序列数据, 最好是6.2.4 的输出文件。此文件需要放置在名为 “文件名” 的较低目录 (文件夹) 中。在 shell 脚本的第53行中, 为 Para_4 指定 “文件名”。以 “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” 结尾的输出文件名给出了二维条形图的坐标 (图 4, igl)。