זיהוי של נוגדנים אנושיים Repertoires על ידי הדור הבא רצפי של עכבר

כל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיים ובאישור ראש הוועדה הלאומית המכון של זיהומיות מחלות בעלי חיים טיפול שימוש. דגימה של PBMCs של מתנדבים מבוגרים בריאים, משמש התוצאה נציג בדו ח זה, היה לבצע עם האישור של ועדת האתיקה של לאומי המכון של המחלות הזיהומיות, טוקיו, יפן, ונכתב מדעת הושג מכל אחד מהמשתתפים באמצעות טופס שאושרו על-ידי ועדת האתיקה. 1. פריימר עיצוב עיצוב אוניברסלי פריימר לפנים כדי cDNA כדי להגביר את בנוגדנים mRNA ללא הטיה של PCR תחל ב- 5′-מרוץ11,12 וטכניקות13 חכם-PCR. עבור הגברה ג’ין VH בנוגדנים, לעצב את רצפי מחלקה ספציפי בנוגדנים באזור קבוע תחל הפוכה8,14 (איור 1 א’).הערה: ניתן להוסיף תג מולטיפלקס רצפים מכל אלה תחל לסמן מולקולות ספריית מקורות דגימה שונים. רצפי ה-PCR מקוננים ניתן גם להוסיף, לפי ספר ההוראות של ערכת שימוש15. פריימר לפנים אוניברסלי 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ צבעי יסוד הפוך העכבר immunoglobulins (Ref.8) IgM_CH1: 5′-CACCAGATTCTTATCAGACAGGGGGCTCTC-3′ IgG1_CH1: 5′-CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG-3′ IgG2c_CH1: 5′-GTACCTCCACACACAGGGGCCAGTGGATAG-3′ IgG3_CH1: 5′-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGACCAAGGGA-3′ IgA_CH1: 5′-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3′ Igκ_CH1: 5′-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG-3′ Igλ_CH1: 5′-CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA-3′ צבעי יסוד הפוך האדם immunoglobulins (Ref.14) IgM_CH1: 5′-GGGAATTCTCACAGGAGACG-3′ IgG_CH1: 5′-AAGACCGATGGGCCCTTG-3′ IgD_CH1: 5′-GGGTGTCTGCACCCTGATA-3′ IgA_CH1: 5′-GAAGACCTTGGGGCTGGT-3′ IgE1_CH1: 5′-GAAGACGGATGGGCTCTGT-3′ IgE2_CH1: 5′-TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG-3′ Igκ_CH1: 5′-TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT-3′ Igλ_CH1: 5′-AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA-3′ טבלה 1: פריימר רצפי ה-PCR-הגברה של immunoglobulins 2. בידוד חומצת גרעין של תאים חיסוניים ורקמות הערה: הנוהל כדלקמן הוא להפקת חומצות גרעין של הטחול העכבר. עם זאת, החלים על אחרים המערכת החיסונית רקמות, תאים אנושיים כגון בלוטות הלימפה או תאי תאי דם היקפיים (PBMCs) (איור 1B). לנתח את רקמות, למשל, הטחול מ העכבר C57BL/6 בן שבוע 8, להעביר את זה דרך רשת נירוסטה (200-400 מיקרומטר) עם 2 מ של PBS מאגר להשיג התאים התפזרו. העברת התליה תא צינור microcentrifuge 2.0 mL, ו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 600 × g ו- 4 הלעפה תרוטרפמט. למחוק את תגובת שיקוע. להוסיף µL 800 ACK מאגר lysing (150 מ מ NH4קלרנית, KHCO 1 מ3, 0.1 מ מ נה2EDTA, pH 7.2) בגדר, דגירה על קרח למשך 2 דקות lyse תאי דם אדומים בתוך הרקמה. לשטוף את תאי רקמות עם 2 מ של PBS 3 x, ואחריו צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 600 × g ו- 4 הלעפה תרוטרפמט. להוסיף µL 800 של ריאגנט isothiocyanate פנול/guanidine בגדר, מערבולת ביסודיות, דגירה -כ-25 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות. להוסיף כלורופורם (200 µL), לנער ידנית 15 s, ואז דגירה למשך 2 דקות כ-25 הלעפה תרוטרפמט. להפריד את השלבים על ידי צנטריפוגה למשך 15 דקות ב 12,000 × g ו- 25 הלעפה תרוטרפמט ולהעביר מימית השלב העליון צינור טריים. הוסף אמצעי אחסון אחד של 70% אתנול, מערבולת בקצרה ולהחיל אותו על העמודה ספין סיליקה. Elute את הרנ א עם 30 – 100 µL של מים. Quantitate הריכוז RNA ראשוני באמצעות של fluorometer (טבלה של חומרים). אחסן את הרנ א מטוהרים ב-80 הלעפה תרוטרפמט. 3. cDNA סינתזה ו- PCR-הגברה הערה: בשיטה המתוארת להלן מבוסס על 5′-מרוץ11,12 ו חכם-PCR טכניקות13. הפרטים ואת אופטימיזציה של התגובה מתוארים בספר ההדרכה של ערכת ה- 15. החומרים ההתחלה עבור העכבר בנוגדנים הם הדוגמה מהצעד 2.10. חומרי המוצא בנוגדנים האדם הן דגימת רקמות אנושיות, אקס PBMC, התייחס כמתואר בצעדים 2.3 ל 2.10. לסנתז את cDNA הראשון-strand 2 עד 10 µg של תבנית הרנ א סה כ באמצעות פריימר תקליטורים 5′-מרוץ (oligo-dT-מכיל) ו- oligonucleotide חכם-PCR (טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן15. עבור העכבר נוגדנים cDNA להגביר את-PCR עם אמינות גבוהה DNA פולימראז באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי בנוגדנים ספציפיים מחלקה הפוכה תחל (טבלה 1). הגדר את תנאי הרכיבה תרמי כמו: 94 הלעפה תרוטרפמט במשך 2 דקות, ואז 40 מחזורי הלעפה תרוטרפמט 94 ב-30 s, הלעפה תרוטרפמט 59 ב-30 s, ו- 72 הלעפה תרוטרפמט ב-30 s, ואחריו צעד סופי סיומת ב 72 הלעפה תרוטרפמט במשך 5 דקות.הערה: ניסויים טיפוסי להגביר את שיעורי נוגדן IgM, IgG1, IgG2c, Igk, Igl להיראות תמים, תלויי-Th1 ו Th2 תלוית B תאים (איור 3). עבור בנוגדנים אנושי, לבצע 1סנט באמצעות פריימר לפנים אוניברסלי בנוגדנים ספציפיים מחלקה הפוכה תחל (טבלה 1) עם תג רצפי ה-PCR. לכלול את רצפי אינדקס עבור כל דגימה על-ידי 2nd PCR באמצעות אינדקס רצף תחל. השתמש התנאים הבאים PCR של אנזימים: 94 הלעפה תרוטרפמט למשך 2 דקות, 21 מחזורים (1סנט PCR) או מחזורי 32 (2nd PCR) ב 94 הלעפה תרוטרפמט עבור 30 s, הלעפה תרוטרפמט 59 ב-30 s, הלעפה תרוטרפמט 72 ב-30 s.הערה: ניסויים טיפוסי להגביר IgM IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 ו- IgG4), איגה (IgA1 ו- IgA2), IgE, Igk Igl בנוגדנים ושיעורי להסתכל על כל האוכלוסיות תא B (איור 4). Electrophorese המוצרים PCR ג’ל agarose ולטהר 600-800 bp שברי באמצעות סיליקה ממברנה ספין-טור. Electrophorese המדגם 3.2.1 או 3.2.2 על 2% agarose ג’ל. לדמיין את הלהקות DNA UV-transilluminator, בלו הפרוסה-הג’ל המכיל את הלהקה רחבה בין 600-800 bp. להוסיף 10 מ של קרום מחייב פתרון לכל 10 מ ג של ג’ל פרוסה. לערבב, דגירה ב 50-65 ° C עד הפרוסה ג’ל היא התפרקה לחלוטין. העברת הפתרון ג’ל סיליקה ממברנה ספין-בעמודה. לשטוף פעם עם שטיפה מאגר, elute DNA עם 50 מ של מים נטולי נוקלאז (טבלה של חומרים). לכמת את amplicons מטוהרים עם amplicons fluorometer ובריכה מ בכל כיתה בנוגדנים בכמויות שוות על המיתרים רצף.הערה: בדרך כלל, 2-10 מ”ג אמפליקון DNA שוחזר עבור כל מחלקה בנוגדנים. מערבבים כל פתרון מדגם באותה מידה בכמות הדנ א כדי לתת פתרון 50 מ ל עלייה המכיל 10-20 ng DNA/mL. לקבוע את גודל ואת ריכוז של ספריות באמצעות אלקטרופורזה המבוסס על מיקרו-נים עם ה-DNA שנקודות צ’יפ (טבלה של חומרים). לאחסן את הספריות ב- 20 º C. 4. הגדרות רצף של ספריות צור SampleSheet.cvs עבור רצף הפעלה המציין לדוגמה השם, אינדקס מידע ולהורות להשיג .fastq קבצים בלבד. להפשיר את מחסנית ריאגנט (טבלה של חומרים) לבין הספריות. להפוך 0.2 N NaOH, לדלל את ספריות כדי להשיג את ריכוז מולרי הרצוי. שוטפים ומייבשים את התא זרימה. הוסף 600 מ של ספריית מדולל וחסר שפגע בסימני פתרון לתוך הבאר של מיכל הדיו מגיב. התחל רצף הפעלה. 5. בקרת איכות של הגדרות נתונים לבצע את בקרת האיכות של FASTQ נתונים באמצעות ה-“FASTX-ערכת”16.הערה: דוגמה בסיסית של קביעות הפרמטר המשמש הוא כדלקמן:fastq_quality_trimmer – v -t 20 – l 200 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastq_quality_filter – v – q 20 – p 80 -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq]fastx_reverse_complement – v -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fastq] לעצב את קבצי פלט “חומצת גרעין fasta (.fna)” על ידי ביצוע הפקודה:fastq_to_fasta – v – n -i [InFilename.fastq] -o [InFilename.fna] 6. חילוץ וניתוח של אימונוגלובולינים רצפים מנתונים .fna הערה: התוכניות דוגמה ךלהמב בסביבת UNIX. נא להשתמש בהם כמו למשל הפניות כי הביצועים תלויים מערכת ההפעלה ואת סביבת החומרה. המחברים לא מקבלים כל אחריות עבור שגיאות או השמטות. שפות תכנות, Perl17, R18ומודולים נדרש צריך להיות מותקן בהתאם להוראות מצוטט באתר אינטרנט. התוכנית IgBLAST צריך להיות מותקן בהתאם להוראות19,האתר המתאים20. הורד את הדוגמאות הבאות של תוכניות ללא צורך במיקור חוץ עבור ניתוח רפרטואר של https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:03_PipeLine_Mouse.zip; סט של תוכניות דוגמא עבור הניתוחים של העכבר נוגדן רצפים.05_PipeLine_Human.zip; סט של תוכניות דוגמא עבור הניתוחים של רצפי נוגדנים אנושיים. תמצית הנוגדן קורא נתונים רצף: לחלץ את רצפי אימונוגלובולינים (Ig) של כל מחלקה-Ig מן הנתונים (.fna) על-ידי תוכנית Perl הסורקת את רצפי חתימה בכל אזור קבוע אימונוגלובולינים (טבלה 2). על הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:$ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] עבור העכבר בנוגדנים שרשרת אור גנים (IgL) לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:$ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] על הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים אנושי, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:$ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] על הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים אנושי, לחלץ את הקריאות על ידי ביצוע הפקודה:$ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [קלט filename] [filename פלט (סיומת)] ביאור ולבדוק את הפרודוקטיביות של רקומבינציה גנים V (D) J:הערה: בשיטה המתוארת להלן מנצל העצמאי IgBLAST19 הביאור מקטעי גנים V (D) J ברצף. להגדיר את מסד הנתונים עבור הגנים V (D) J קביעות הפרמטר עבור IgBLAST כמו שמתואר20. ביאור הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים העכבר על ידי ביצוע הפקודה:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-אורגניזם העכבר – domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName ביאור הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים העכבר על ידי ביצוע הפקודה:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt-אורגניזם העכבר – domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/mouse_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName ביאור הגנים שרשרת כבדה (וקשתות) בנוגדנים האנושית על ידי ביצוע הפקודה:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-אורגניזם אנושי – domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/Human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName ביאור הגנים שרשרת אור (IgL) בנוגדנים האנושית על ידי ביצוע הפקודה:$ igblastn-germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt-germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt-germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt-אורגניזם אנושי – domain_system imgt-שאילתה. / $InFile-auxiliary_data $IGDATA/optional_ file/human_gl.aux-show_translation – outfmt 7 >>. / $OutName דמיינו התכונה העולמית של רפרטואר נוגדן. דמיינו את הרפרטואר וקשתות של עכבר על ידי ביצוע הפקודה:$ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.shהערה: קובץ הקלט הוא filename.fna (רצף נתונים), רצוי בקובץ הפלט מ 6.2.1. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) בשם “filename”. בשורה 50 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם “קובץ” עבור Para_4. לדמיין את הרפרטואר IgH האנושית על ידי ביצוע הפקודה:$ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.shהערה: קובץ הקלט הוא filename.fna רצף נתונים, רצוי בקובץ הפלט של 6.2.3. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) השם זה “filename”. קו 46 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם “קובץ” עבור Para_4. דמיינו את הרפרטואר IgL העכבר על ידי ביצוע הפקודה:$ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.shהערה: עם צינור זה, Igk ו- Igl מעובדים/ת. קובץ הקלט הוא filename.fna (רצף נתונים), רצוי בקובץ הפלט מ 6.2.2. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריית התחתון (תיקיה) בשם “filename”. קו 53 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות שם “קובץ” עבור Para_4. השם של קובץ הפלט, הסוף עם “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” נותן את קואורדינטות גרף עמודות דו-ממדי (איור 3, IgL). דמיינו את הרפרטואר IgL האנושית על ידי ביצוע הפקודה:$ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.shהערה: עם צינור זה, Igk ו- Igl מעובדים/ת. קובץ הקלט הוא filename.fna רצף נתונים, רצוי בקובץ הפלט של 6.2.4. קובץ זה צריך להיות ממוקם בספריה התחתון (תיקיה) בשם “filename”. קו 53 של קובץ ה-script של מעטפת, להקצות “filename” עבור Para_4. שם הקובץ פלט המסתיימים “_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt” נותן את קואורדינטות גרף עמודות דו-ממדי (איור 4, IgL).