Strukturellt relaterade proteiner utöva ofta olika biologiska funktioner. Utbyte av motsvarande regioner i dessa proteiner för att skapa chimära proteiner utgör en innovativ metod för att identifiera kritiska protein regioner som ansvarar för deras funktionella skillnader.
Målet med detta protokoll omfattar utformningen av chimära proteiner där distinkta regioner av ett protein ersättas med deras motsvarande sekvenser i ett strukturellt likartade protein, för att fastställa funktionella betydelsen av dessa regioner. Sådan chimärer genereras genom ett nästlade PCR-protokoll med hjälp av överlappande DNA-fragment och adekvat primers, följt av deras uttryck inom ett däggdjur system för att säkerställa infödda sekundärt strukturera och post-translationella modifieringar.
Den funktionella rollen för en distinkt region framgår sedan av en förlust av aktivitet av chimera i ett lämpligt avläsning test. Följaktligen identifieras regioner härbärgerat en uppsättning kritiska aminosyror, vilket ytterligare kan kontrolleras med kompletterande tekniker (t.ex. webbplats riktad mutagenes) för att öka molekylär upplösning. Begränsad till fall där ett strukturellt relaterade protein med olika funktioner kan hittas, men chimära proteiner har lyckat använts att identifiera kritiska bindande regioner i proteiner såsom cytokiner och cytokin receptorer. Denna metod är särskilt lämplig i fall där proteinets funktionella regioner inte är väldefinierade och utgör ett värdefullt första steg i riktad evolution metoder att begränsa Regionkommittén sevärdheter och minska den screening ansträngningen inblandade.
Flera typer av proteiner, inklusive cytokiner och tillväxtfaktorer, grupperas i familjer vars medlemmar delar liknande tredimensionella strukturer men ofta utöva olika biologiska funktioner1,2. Denna funktionella mångfald är oftast en följd av små skillnader i aminosyra sammansättning inom molekylens aktiva platser3. Identifiering av sådana platser och funktionella bestämningsfaktorer inte bara erbjuder evolutionära insikter utan också att utforma mer specifika agonister och hämmare4. Det stora antalet skillnader i rester sammansättning ofta hittas mellan strukturellt relaterade proteiner komplicerar dock denna uppgift. Även om att konstruera stora bibliotek som innehåller hundratals mutanter är numera möjligt, bedöma varje enskild rester variation och kombinationer av dem fortfarande är en utmanande och tidskrävande insats5.
Tekniker att bedöma funktionella betydelsen av stora protein regioner är således av värde för att minska antalet möjliga rester till en hanterbar nummer6. Trunkerade proteiner har varit den mest använda metoden att tackla denna fråga. Följaktligen är regioner anses vara funktionellt relevanta om funktionen protein under studien påverkas av strykningen av en viss region7,8,9. En stor begränsning med denna metod är dock att strykningar kan påverka proteinets sekundärt strukturera, leder till Skellefteåsjukan, aggregering och oförmågan att studera avsedda regionen. Ett bra exempel är en stympad version av cytokin oncostatin M (OSM), som studerat en inre radering som är större än 7 rester resulterade i en felveckning mutant som inte kunde ytterligare10.
Generering av chimära proteiner utgör ett alternativ och innovativa förhållningssätt som tillåter analys av större protein regioner. Målet med denna metod är att utbyta regioner av intresse i ett protein av strukturellt relaterade sekvenser i ett annat protein, för att kunna bedöma bidraget från de utbytta delarna till specifika biologiska funktioner. Ofta används i fältet för signalering receptorer att identifiera funktionella domäner11,12, är chimär proteiner särskilt användbart för att studera protein familjer med lite aminosyra identitet men bevarade sekundärt strukturera. Lämpliga exempel kan hittas i klassen av interleukin-6 (IL-6) typ cytokiner, såsom interleukin-6 och ciliär neurotrofisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hämmande faktor (LIF) och OSM (20% identitet)6, där den följande protokoll är baserad.
Generering av chimära proteiner utgör en mångsidig teknik, vilket kan gå bortom gränserna för trunkerade proteiner att hantera frågor såsom Modulariteten av cytokin-receptor bindande domäner13. Utformningen av chimärer är ett viktigt steg i denna typ av studier och kräver noggrant övervägande. Preliminära studier för att fastställa funktionella domäner kräver generellt substitution av breda regioner i en första fas, medan mindre ersättare av variabla längder är mer lämpade …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöds av den Max Planck-sällskapet och Schüchtermann-kliniken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denna forskning publicerades ursprungligen i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB öglan och D-helix i bindningsställe III av mänskliga Oncostatin M (OSM) krävs för OSM receptor aktiveringen. J. Biol. Chem. 2018. 18:7017-7029. © författarna.
Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
LE agarose | Biozym | 840004 | |
Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |