Identificación de regiones de la proteína funcional a través de la construcción de la proteína quimérica
Summary
Proteínas estructuralmente relacionadas con frecuencia ejercen distintas funciones biológicas. El intercambio de equivalentes regiones de estas proteínas para crear proteínas quiméricas constituye un enfoque innovador para identificar las regiones de la proteína crítica que son responsables de su divergencia funcional.
Abstract
El objetivo de este protocolo comprende el diseño de proteínas quiméricas en la que distintas regiones de una proteína son sustituidas por sus correspondientes secuencias de una proteína estructural similar, con el fin de determinar la importancia funcional de estas regiones. Tales quimeras se generan mediante un protocolo PCR anidado utilizando fragmentos de DNA traslapados y adecuadamente diseñado cartillas, seguidos de su expresión dentro de un sistema mamífero nativo estructura secundaria y modificaciones post-traduccionales.
El papel funcional de una región distinta entonces indica una pérdida de actividad de la quimera en un ensayo de lectura apropiado. En consecuencia, se identifican las regiones albergando un conjunto de aminoácidos esenciales, que pueden ser defendidos por técnicas complementarias (por ejemplo, mutagénesis sitio-dirigida) para aumentar la resolución molecular. Aunque limitada a los casos en que se encuentra una proteína estructuralmente relacionada con diferentes funciones, las proteínas quiméricas han sido empleadas con éxito para identificar las regiones de Unión críticos en proteínas como receptores de citoquinas y citoquinas. Este método está especialmente indicado en casos en que las regiones funcionales de la proteína no están bien definidas y constituye un valioso primer paso en enfoques de evolución dirigida a reducir las regiones de interés y reducir el esfuerzo de investigación involucrado.
Introduction
Varios tipos de proteínas, incluyendo citoquinas y factores de crecimiento, se agrupan en familias cuyos miembros comparten estructuras tridimensionales similares pero a menudo ejercen distintas funciones biológicas1,2. Esta diversidad funcional suele ser la consecuencia de pequeñas diferencias en la composición de aminoácidos dentro de sitios activos3 de la molécula. Identificación de dichos sitios y determinantes funcionales no sólo ofrece valiosa información evolutiva sino también para el diseño de los agonistas e inhibidores más específicos4. Sin embargo, el gran número de diferencias en la composición del residuo encontrado con frecuencia entre proteínas estructuralmente relacionadas complica esta tarea. A pesar de construir grandes bibliotecas que contienen cientos de mutantes hoy en día es factibles, evaluar cada variación de solo residuos y combinaciones de ellos sigue siendo un esfuerzo difícil y desperdiciador de tiempo5.
Técnicas de evaluación de la importancia funcional de las regiones de la proteína grande son así de valor para reducir el número de posibles residuos a un número manejable6. Proteínas truncadas han sido el enfoque más utilizado para abordar este asunto. En consecuencia, las regiones se consideran funcionalmente relevante si la función de la proteína bajo estudio es afectada por la eliminación de una región particular7,8,9. Sin embargo, una limitación importante de este método es que deleciones pueden afectar a la estructura secundaria de la proteína, llevando a mal plegamiento, la agregación y la imposibilidad de estudiar la región prevista. Un buen ejemplo es una versión truncada de la citoquina Oncostatina M (OSM), en el que una canceladura interna más grande de 7 residuos dio lugar a un mutante mal plegado que no podía ser más había estudiado10.
La generación de proteínas quiméricas constituye un enfoque alternativo e innovador que permite el análisis de regiones más grandes de proteína. El objetivo de este método es para el intercambio de regiones de interés en una proteína por secuencias estructuralmente relacionadas de otra proteína, con el fin de evaluar la contribución de las secciones sustituyó a funciones biológicas específicas. Ampliamente utilizado en el campo de la señalización de receptores para identificar dominios funcionales11,12, proteínas quiméricas son particularmente útiles para el estudio de familias de proteínas con poca identidad del aminoácido pero conservada estructura secundaria. Apropiado pueden encontrarse ejemplos en la clase de interleucina 6 (IL-6) tipo citoquinas, tales como interleukin-6 y ciliary neurotrophic factor (identidad de secuencia de 6%)13 o leucemia factor inhibitorio (LIF) y OSM (20% identidad)6, en la que el siguiendo el protocolo se basa.
Protocol
Representative Results
Discussion
La generación de proteínas quiméricas constituye una técnica versátil, que puede ir más allá de los límites de proteínas truncadas a abordar cuestiones tales como la modularidad del receptor del cytokine enlace dominios13. El diseño de quimeras es un paso clave en este tipo de estudios y requiere una cuidadosa consideración. Estudios preliminares para establecer dominios funcionales generalmente requiere sustitución de amplias regiones en una primera fase, mientras que los reemplazos m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la sociedad Max Planck y la clínica Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemania). Parte de esta investigación fue publicado originalmente en el Journal of Biological Chemistry. Adrian Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. El lazo del AB y D-hélice en sitio obligatorio III de humano Oncostatina M (OSM) se requieren para la activación del receptor OSM. J Biol Chem 2018; 18:7017-7029. © los autores.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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