Identificação de regiões de proteína funcional através de construção de proteínas quiméricas
Summary
Proteínas estruturalmente relacionadas frequentemente exercem funções biológicas distintas. A troca das regiões equivalentes destas proteínas a fim de criar proteínas quiméricas constitui uma abordagem inovadora para identificar regiões críticas da proteína que são responsáveis pela sua divergência funcional.
Abstract
O objetivo do presente protocolo abrange o design das proteínas quiméricas em que regiões distintas de uma proteína são substituídas por suas sequências correspondentes em uma proteína estruturalmente semelhante, a fim de determinar a importância funcional destas regiões. Tais quimeras são geradas através de um protocolo PCR aninhado usando a sobreposição de fragmentos de DNA e adequadamente projetado cartilhas, seguidas por sua expressão dentro de um sistema de mamíferos para garantir estrutura secundária nativa e modificações borne-translational.
O papel funcional de uma região distinta é então indicado por uma perda de atividade da Quimera, em um ensaio de leitura apropriado. Em consequência, são identificadas regiões abrigando um conjunto de aminoácidos essenciais, que pode ser ainda mais selecionados por técnicas complementares (por exemplo, mutagenesis local-dirigido) para aumentar a resolução molecular. Embora limitada a casos em que uma proteína estruturalmente relacionada com funções diferentes pode ser encontrada, proteínas quiméricas têm sido empregadas com sucesso para identificar as regiões críticas de ligação em proteínas tais como receptores de citocinas e citocinas. Este método é particularmente apropriado em casos em que as regiões funcionais da proteína não estão bem definidas e constitui um valioso primeiro passo na evolução dirigida abordagens para diminuir as regiões de interesse e reduzir o esforço de rastreio envolvido.
Introduction
Vários tipos de proteínas, incluindo citocinas e fatores de crescimento, são agrupados em famílias cujos membros compartilham semelhantes estruturas tridimensionais, mas muitas vezes exercem funções biológicas distintas1,2. Esta diversidade funcional costuma ser a consequência de pequenas diferenças na composição de aminoácidos dentro sites ativos3 da molécula. Identificação de tais sites e determinantes funcionais não só oferecem insights valiosos evolutivos mas também projetar mais específico agonistas e inibidores da4. No entanto, o grande número de diferenças na composição do resíduo frequentemente encontrado entre proteínas estruturalmente relacionadas complica essa tarefa. Mesmo que a construção de grandes bibliotecas contendo centenas de mutantes hoje em dia é viáveis, avaliando cada variação único resíduo e combinações deles continua a ser um esforço desafiante e demorado5.
Técnicas para avaliar a importância funcional das regiões grandes proteínas são, portanto, de valor para reduzir o número de resíduos possíveis para um número gerenciável6. Proteínas truncadas tem sido a abordagem mais utilizada para resolver este problema. Nesse sentido, as regiões são consideradas funcionalmente relevantes se a função da proteína em estudo é afectada pela exclusão de uma determinada região7,8,9. No entanto, uma grande limitação deste método é que as exclusões podem afetar a estrutura secundária da proteína, levando a enrolamento, agregação e a incapacidade para estudar a região pretendida. Um bom exemplo é uma versão truncada da citocina oncostatin M (OSM), no qual uma exclusão interna maior do que 7 resíduos resultaram em um mutante misfolded que não poderia ser mais estudou10.
A geração de proteínas quiméricas constitui uma abordagem alternativa e inovadora que permite a análise de regiões maiores da proteína. O objetivo desse método é a troca de regiões de interesse em uma proteína por sequências estruturalmente relacionadas em uma outra proteína, a fim de avaliar a contribuição das seções substituiu a funções biológicas específicas. Amplamente utilizado no campo da sinalização de receptores para identificar domínios funcionais11,12, proteínas quiméricas são particularmente úteis para estudar famílias da proteína com pouco aminoácido identidade mas conservada estrutura secundária. Adequadas exemplos podem ser encontrados na classe de interleucina-6 (IL-6) tipo citocinas, como interleucina-6 e ciliar neurotrophic factor (6% identidade de sequência)13 ou leucemia inibitório fator (LIF) e (20% de identidade) OSM6, em que o seguindo o protocolo é baseado.
Protocol
Representative Results
Discussion
A geração de proteínas quiméricas constitui uma técnica versátil, que é capaz de ir além dos limites das proteínas truncadas para abordar questões como a modularidade do receptor de citocina-ligação domínios13. O projeto de quimeras é um passo fundamental neste tipo de estudos e requer cuidadosa consideração. Estudos preliminares para estabelecer domínios funcionais geralmente exigirá a substituição das grandes regiões, numa primeira fase, enquanto menores substituições de c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela sociedade Max Planck e a clínica-Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Alemanha). Parte desta pesquisa foi publicado originalmente na revista de química biológica. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, s., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. O laço do AB e D-hélice no sítio de ligação III de humano Oncostatin M (OSM) são necessários para a ativação do receptor OSM. J. Biol Chem. 2018; 18:7017-7029. © os autores.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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