Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon
Summary
Strukturelt relaterte proteiner utøve ofte forskjellige biologiske funksjoner. Utveksling av tilsvarende områder av disse proteinene vil opprette chimeric proteiner utgjør en innovativ tilnærming for å identifisere kritiske protein områder som er ansvarlig for deres funksjonelle divergens.
Abstract
Målet med denne protokollen omfatter utformingen av chimeric proteiner som atskilte områder av et protein er erstattet med de tilsvarende sekvensene i en samme protein, for å fastslå funksjonelle betydningen av disse regionene. Slike chimeras genereres ved hjelp av en nestede PCR-protokoll overlappende DNA fragmenter og tilstrekkelig utviklet primere, etterfulgt av deres uttrykk innenfor et pattedyr system å sikre opprinnelige sekundære struktur og post-translasjonell modifikasjoner.
Funksjonell rolle en distinkt region angis deretter med tap av aktivitet chimera i riktig avlesning analysen. I følge identifiseres regioner huse en rekke kritiske aminosyrer, som kan bli ytterligere vist av komplementære teknikker (f.eks området-rettet mutagenese) for å øke molekylær oppløsning. Begrenset til saker som et strukturelt relaterte protein med ulike funksjoner kan bli funnet, har chimeric proteiner vært vellykket ansatt å identifisere kritiske bindende områder i proteiner som cytokiner og cytokin reseptorer. Denne metoden er spesielt godt egnet i tilfeller der den protein funksjonelle områder ikke er godt definert, og utgjør en verdifull første skritt i regissert utvikling tilnærminger til å begrense områdene rundt og redusere screening krefter involvert.
Introduction
Flere typer proteiner, inkludert cytokiner og vekstfaktorer, er gruppert i familier hvis medlemmer dele lignende tredimensjonale strukturer, men ofte utøve forskjellige biologiske funksjoner1,2. Dette funksjonelle mangfoldet er vanligvis konsekvensen av små forskjeller i aminosyre komposisjon i molekylets aktive nettsteder3. Identifikasjon av slike nettsteder og funksjonelle determinanter ikke bare tilbyr verdifull evolusjonære innsikt men også utforme mer spesifikke agonister og hemmere4. Men kompliserer mange forskjeller i rester komposisjon ofte funnet mellom strukturelt relaterte proteiner denne oppgaven. Selv om bygge store biblioteker som inneholder hundrevis av mutanter er i dag mulig, vurdere hver enkelt rester Variant kombinasjoner av dem fortsatt en tidkrevende og utfordrende innsats5.
Teknikker vurdere funksjonelle betydningen av store protein regioner er dermed å redusere antall mulig rester til et håndterlig antall6. Avkortet proteiner er den mest brukte måten å håndtere dette problemet. Følgelig regnes områder være funksjonelt relevant hvis funksjonen protein under studien påvirkes av slettingen av en bestemt region7,8,9. En stor begrensning av denne metoden er imidlertid at slettinger kan påvirke protein’s sekundære struktur, fører til misfolding, aggregering og manglende evne til å studere den tiltenkte regionen. Et godt eksempel er en avkortet versjon av cytokin oncostatin M (OSM), som studerte en intern sletting større enn 7 rester resulterte i en misfolded mutant som ikke kunne ytterligere10.
Generering av chimeric proteiner utgjør en alternativ og nyskapende tilnærming som tillater analyse av større protein regioner. Målet med denne metoden er å utveksle områder av interesse i et protein av strukturelt relaterte sekvenser i en annen protein, for å vurdere bidrag erstattet delene til bestemte biologiske funksjoner. Mye brukt i feltet signalnettverk reseptorer å identifisere funksjonelle domener11,12, er chimeric proteiner spesielt nyttig å studere protein familier med liten aminosyre identitet men bevarte sekundære struktur. Aktuelle eksempler kan bli funnet i klassen av interleukin-6 (IL-6) type cytokiner, slik som interleukin-6 og ciliary nevrotropisk faktor (6% sekvens identitet)13 eller leukemi hemmende faktor (LIF) og OSM (20% identitet)6, som den etter protokoll basert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Generering av chimeric proteiner utgjør en allsidig teknikk, hvilke er kjøpedyktig gå utover grensene for avkortet proteiner til adressen spørsmål som modularitet cytokin-reseptor bindende domener13. Utformingen av chimeras er et viktig skritt i denne typen studier, og krever nøye overveielse. Forstudier å etablere funksjonelle domener krever generelt substitusjon av brede områder i en første fase, mens mindre erstatninger med variabel lengde er mer egnet til detaljerte studier av ett. Sp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Max Planck samfunnet og Schüchtermann-klinikken (Bad Rothenfelde, Tyskland). En del av denne forskningen ble opprinnelig publisert i Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, s., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. AB loop og D-helix i binding området III av menneskelig Oncostatin M (OSM) kreves for OSM reseptor aktivisering. J. Biol. kjemiske 2018; 18:7017-7029. © forfatterne.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
References
- Huising, M. O., Kruiswijk, C. P., Flik, G. Phylogeny and evolution of class-I helical cytokines. The Journal of Endocrinology. 189 (1), 1-25 (2006).
- Brocker, C., Thompson, D., Matsumoto, A., Nebert, D. W., Vasiliou, V. Evolutionary divergence and functions of the human interleukin (IL) gene family. Human Genomics. 5 (1), 30-55 (2010).
- Bravo, J., Heath, J. K. Receptor recognition by gp130 cytokines. The EMBO Journal. 19 (11), 2399-2411 (2000).
- Schneider, G., Fechner, U. Computer-based de novo. design of drug-like molecules. Nature Reviews Drug Discovery. 4 (8), 649-663 (2005).
- Heydenreich, F. M., Miljuš, T., Jaussi, R., Benoit, R., Milić, D., Veprintsev, D. B. High-throughput mutagenesis using a two-fragment PCR approach. Scientific Reports. 7 (1), 6787 (2017).
- Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Gajawada, P., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. The AB loop and D-helix in binding site III of human Oncostatin M (OSM) are required for OSM receptor activation. The Journal of Biological Chemistry. 293 (18), 7017-7029 (2018).
- Wang, Y., Pallen, C. J. Expression and characterization of wild type, truncated, and mutant forms of the intracellular region of the receptor-like protein tyrosine phosphatase HPTP beta. The Journal of Biological Chemistry. 267 (23), 16696-16702 (1992).
- Lim, J., Yao, S., Graf, M., Winkler, C., Yang, D. Structure-function analysis of full-length midkine reveals novel residues important for heparin binding and zebrafish embryogenesis. The Biochemical Journal. 451 (3), 407-415 (2013).
- Kim, K. -. W., Vallon-Eberhard, A., et al. In vivo structure/function and expression analysis of the CX3C chemokine fractalkine. Blood. 118 (22), 156-167 (2011).
- Chollangi, S., Mather, T., Rodgers, K. K., Ash, J. D. A unique loop structure in oncostatin M determines binding affinity toward oncostatin M receptor and leukemia inhibitory factor receptor. The Journal of Biological Chemistry. 287 (39), 32848-32859 (2012).
- Aasland, D., Schuster, B., Grötzinger, J., Rose-John, S., Kallen, K. -. J. Analysis of the leukemia inhibitory factor receptor functional domains by chimeric receptors and cytokines. 生物化学. 42 (18), 5244-5252 (2003).
- Hermanns, H. M., Radtke, S., et al. Contributions of leukemia inhibitory factor receptor and oncostatin M receptor to signal transduction in heterodimeric complexes with glycoprotein 130. Journal of Immunology. 163 (12), 6651-6658 (1999).
- Kallen, K. J., Grötzinger, J., et al. Receptor recognition sites of cytokines are organized as exchangeable modules. Transfer of the leukemia inhibitory factor receptor-binding site from ciliary neurotrophic factor to interleukin-6. The Journal of Biological Chemistry. 274 (17), 11859-11867 (1999).
- Gibrat, J. F., Madej, T., Bryant, S. H. Surprising similarities in structure comparison. Current Opinion in Structural Biology. 6 (3), 377-385 (1996).
- Madej, T., Lanczycki, C. J., et al. MMDB and VAST+: tracking structural similarities between macromolecular complexes. Nucleic Acids Research. 42, 297-303 (2014).
- Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nature Structural Biology. 10 (12), 980 (2003).
- Biasini, M., Bienert, S., et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research. 42, 252-258 (2014).
- Bordoli, L., Kiefer, F., Arnold, K., Benkert, P., Battey, J., Schwede, T. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols. 4 (1), 1-13 (2009).
- Maglott, D. R., Katz, K. S., Sicotte, H., Pruitt, K. D. NCBI’s LocusLink and RefSeq. Nucleic Acids Research. 28 (1), 126-128 (2000).
- Sievers, F., Wilm, A., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Molecular Systems Biology. 7, 539 (2011).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108 (2), 193-199 (1991).
- Barbas, C. F., Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. Quantitation of DNA and RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2007).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and Transformation of Competent E. coli Using Calcium Chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with SDS: Minipreparation. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
- Green, M. R., Sambrook, J. Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis with Sodium Dodecyl Sulfate: Maxipreps. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (1), 093351 (2018).
- Hopkins, R. F., Wall, V. E., Esposito, D. Optimizing transient recombinant protein expression in mammalian cells. Methods in Molecular Biology. 801, 251-268 (2012).
- Wang, X., Lupardus, P., Laporte, S. L., Garcia, K. C. Structural biology of shared cytokine receptors. Annual Review of Immunology. 27, 29-60 (2009).
- Deller, M. C., Hudson, K. R., Ikemizu, S., Bravo, J., Jones, E. Y., Heath, J. K. Crystal structure and functional dissection of the cytostatic cytokine oncostatin. Structure. 8, 863-874 (2000).
- Huyton, T., Zhang, J. -. G., et al. An unusual cytokine:Ig-domain interaction revealed in the crystal structure of leukemia inhibitory factor (LIF) in complex with the LIF receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12737-12742 (2007).
- Oezguen, N., Kumar, S., Hindupur, A., Braun, W., Muralidhara, B. K., Halpert, J. R. Identification and analysis of conserved sequence motifs in cytochrome P450 family 2. Functional and structural role of a motif 187RFDYKD192 in CYP2B enzymes. The Journal of Biological Chemistry. 283 (31), 21808-21816 (2008).
- Wong, A., Gehring, C., Irving, H. R. Conserved Functional Motifs and Homology Modeling to Predict Hidden Moonlighting Functional Sites. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 82 (2015).
- McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR. Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).
- Mamedov, T. G., Pienaar, E., et al. A fundamental study of the PCR amplification of GC-rich DNA templates. Computational Biology and Chemistry. 32 (6), 452-457 (2008).
- Park, J., Throop, A. L., LaBaer, J. Site-specific recombinational cloning using gateway and in-fusion cloning schemes. Current Protocols in Molecular Biology. 110, 1-23 (2015).
- Bitinaite, J., Rubino, M., Varma, K. H., Schildkraut, I., Vaisvila, R., Vaiskunaite, R. USER friendly DNA engineering and cloning method by uracil excision. Nucleic Acids Research. 35 (6), 1992-2002 (2007).
- Gibson, D. G., Young, L., Chuang, R. -. Y., Venter, J. C., Hutchison, C. A., Smith, H. O. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro. to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. In-fusion assembly: seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations. BioTechniques. 43 (3), 354-359 (2007).
