공상 단백질 구축을 통한 기능성 단백질 영역 식별
Summary
구조적으로 관련된 단백질 자주 가지 생물 학적 기능을 발휘 한다. 공상 단백질을 만들기 위해이 단백질의 동등한 지역 교환 그들의 기능 차이 대 한 책임은 중요 한 단백질 영역을 식별 하는 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다.
Abstract
이 프로토콜의 목표는 단백질의 고유 영역이이 지역의 기능적 중요성을 결정 하기 위하여 구조적으로 유사한 단백질에서의 해당 시퀀스에 의해 대체 됩니다 공상 단백질의 디자인을 포함. 그런 키메라 겹치는 DNA 파편을 사용 하 여 중첩 된 PCR 프로토콜에 의하여 생성 하 고 적절 하 게 설계 된 뇌관, 뒤에 기본 보조 구조와 포스트 번역 상 수정 되도록 포유류 시스템 내에서 그들의 식.
고유 영역의 기능 역할 다음 적절 한 판독 분석 결과에 키메라의 활동의 손실에 의해 표시 됩니다. 결과 중요 한 아미노산의 집합을 품고 지역 식별 됩니다는 분자 해상도 높이기 위해 보완 기술 (예: 사이트 감독 mutagenesis)에 의해 추가 상영 될 수 있습니다. 제한 경우에는 서로 다른 기능을 가진 구조적으로 관련된 단백질을 찾을 수 있습니다, 비록 공상 단백질 cytokines, 사이토카인 수용 체 등 단백질에 중요 한 바인딩 영역을 식별 하 성공적으로 고용 되어 있다. 이 메서드는 단백질의 기능 지역 잘 정의 되지 않은 경우에 특히 적합 하며 감독된 진화 접근 관심 영역을 좁혀 하 고 관련된 심사 노력을 줄이기 위해 중요 한 첫 번째 단계를 구성.
Introduction
여러 종류의 단백질, cytokines 그리고 성장 인자를 포함 하 여 가족 구성원 유사한 3 차원 구조를 공유 하지만 고유한 생물학적 기능1,2를 자주 발휘에 그룹화 됩니다. 이 기능의 다양성 일반적으로 아미노산 구성 분자의 활성 사이트3내에 있는 작은 다름의 결과 이다. 이러한 사이트와 기능적인 결정 요인의 식별 제공 하지 않습니다만 중요 한 진화 통찰력 뿐만 아니라 좀 더 구체적인 촉진제와 억제제4디자인. 그러나, 구조상으로 관련된 단백질 사이 자주 발견 잔류물 구성에 있는 다름의 많은이 작업을 복잡. 포함 된 대규모 라이브러리를 구축 돌연변이의 수백은 현재 가능 하 고, 모든 단일 잔류물 변화를 평가 하 고 그들의 조합을 도전적이 고 시간이 걸리는 노력5에 아직도 남아 있다.
큰 단백질 영역의 기능적 중요성 평가 기법 관리 번호6에 가능한 잔류물의 수를 줄이기 위해 값의 따라서 이다. 잘린된 단백질이이 문제를 해결 하기 위해 가장 많이 사용 된 접근 되었습니다. 따라서 지역 연구에서 단백질 기능 특정 지역7,,89의 삭제에 의해 영향을 받는 경우 기능적으로 관련 된 것으로 간주 됩니다. 그러나,이 방법의 주요 한계는 삭제 misfolding, 집계 및 대상된 지역 연구를 선도 하는 단백질의 이차 구조, 영향을 미칠 수 있습니다. 좋은 예는 cytokine oncostatin M (OSM), 있는 내부 삭제 7 잔류물 귀착되 었 다 더 수 없습니다 misfolded 돌연변이 보다 더 큰 공부10의 잘린된 버전입니다.
공상 단백질의 생성 더 큰 단백질 영역의 분석을 허용 하는 대체 하 고 혁신적인 접근 방식을 구성 합니다. 이 방법의 목표는 특정 생물 학적 기능을 대체 섹션의 기여를 평가 다른 단백질에서 구조적으로 관련된 시퀀스에 의해 단백질에 관심 영역을 교환. 식별 기능 도메인11,12수용 체 신호의 분야에서 널리 이용 된다, 공상 단백질은 특히 유용 단백질 가족 작은 아미노산 정체성만 보존된 이차 구조를 공부. 인터 루 킨-6 및 속눈썹 neurotrophic 요인 (6% 순서 신원)13 또는 백혈병 금지 요인 (LIF) 및 OSM (20% 신원)6에 같은 인터 루 킨-6 (일리노이-6) 유형 cytokines의 클래스에 적절 한 예를 찾을 수 있습니다는 다음 프로토콜은 근거한 다.
Protocol
Representative Results
Discussion
공상 단백질의 생성 cytokine 수용 체 바인딩 도메인13의 모듈화 등 주소 질문에 잘린된 단백질의 한계를 넘어 이동 할 수 있는 다양 한 기술을 구성 합니다. 키메라의 디자인 연구의이 종류에 있는 중요 한 단계 이며, 신중한 검토를 요구 한다. 일반적으로 예비 연구 기능 도메인을 설정 하는 가변 길이의 작은 교체는 단일 영역의 상세한 연구에 더 적합 하는 동안 첫 번째 단계에서 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 맥스 플랑크 사회와 Schüchtermann-클리닉 (바트, 독일)에 의해 지원 되었다. 이 연구의 일부 생물 화학의 저널에 출판 되었다. 아드리안 Segarra, J. M., 쉰들러, 북 아 일, Gajawada, P., Lörchner, H., 브라운, 토니 & Pöling, 제이 AB 루프 및 D-나선형 바인딩 사이트 III 인간 Oncostatin M (OSM)의에서는 OSM 수용 체 활성화 필요 합니다. J. Biol. 화학 2018; 18:7017-7029. © 저자.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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