キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定
Summary
構造的に関連蛋白質はよく明確な生物学的機能を発揮します。キメラ蛋白質を作成するためにこれらの蛋白質の相当領域の交換は、彼らの機能の相違に責任がある重大な蛋白質の領域を識別するために革新的なアプローチを構成します。
Abstract
このプロトコルの目標には、タンパク質の異なる領域がこれらの領域の機能の重要度を決定するために構造が似ているタンパク質に対応するシーケンスに置き換えられてキメラ蛋白質の設計が含まれます。このようなキメラが重なり合う DNA のフラグメントを使用して入れ子になった PCR のプロトコルによって生成され、十分なネイティブの二次構造と翻訳後修飾ように哺乳類システム内でその式の前のプライマーを設計しました。
異なる領域の機能的な役割は、適切な読み出しアッセイにおけるキメラの活動の損失によって示されます。その結果、一連の重要なアミノ酸をかくまっている地域が特定される、相補的な技術 (例えばサイト指示された突然変異誘発) 分子の解像度を上げることができますさらに上映されました。異なる関数と構造的に関連蛋白質を見つけることができる場合に限られていますが、キメラ蛋白質を正常にサイトカインとサイトカイン受容体などの蛋白質の重要なバインド領域を識別するために採用されています。このメソッドは、タンパク質の機能領域が、完全に定義されない場合に特に適している、関心領域を絞り込むスクリーニング労力を削減し進化のアプローチの貴重な最初のステップを構成します。
Introduction
サイトカインや成長因子などのタンパク質のいくつかの種類は、家族メンバーが似たような三次元構造を共有ではしばしば明確な生物学的機能1,2でグループ化されます。この機能の多様性は、通常分子の活性部位3内のアミノ酸組成のわずかな違いの結果です。このようなサイトおよび機能の決定要因の同定のみを提供しない貴重な進化への洞察もアゴニスト阻害剤の詳細4を設計します。ただし、構造的に関連蛋白質の間に頻繁に見られる残基組成の相違の多数は、このタスクを複雑にします。何百もの突然変異体は可能、1 つの残基のすべての変化を評価する今日を含む大規模なライブラリを構築するにもかかわらず、それらの組み合わせは依然困難な時間のかかる努力5。
管理番号6に可能な残基の数を減らすために値の大きい蛋白質の領域の機能の重要性を評価する技術をします。切り捨てられたタンパク質は、この問題に取り組むために最もよく使われるアプローチをされています。したがって、地域の場合は調査の下でタンパク質の機能が特定の地域の7,8,9の削除によって影響を受ける機能に関連すると見なされます。ただし、このメソッドの主な制限は削除が折りたたみ、集計、目的の領域を研究することができないにつながるタンパク質の二次構造に影響を与えることができます。良い例は、サイトカイン オンコスタチン M (OSM)、内部の削除 7 残基がさらにできませんでした誤って折りたたまれた突然変異体の結果よりも大きいが10を勉強したの切り捨てられたバージョンです。
キメラ蛋白質の生成はより大きい蛋白質領域の解析を可能にする革新的な代替アプローチを構成します。このメソッドの目的は、特定の生物学的機能に置き換えられるセクションの貢献度を評価するために別のタンパク質に構造的に関連するシーケンスによって蛋白質の関心領域を交換することです。機能ドメイン11,12を識別する受容体シグナル伝達の分野で広く使用されているキメラ蛋白質が少しのアミノ酸のアイデンティティが保存された二次構造蛋白質家族の研究に特に有用。インターロイキン 6 (IL-6) 型サイトカインのクラスでインターロイキン-6 および毛様体神経栄養因子 (6% 順序のアイデンティティ)13または白血病抑制的な要因 (LIF) および OSM (20% のアイデンティティ)6のように、適切な例を見つけることができます、次のプロトコルに基づいています。
Protocol
1. キメラ蛋白質の設計 適切な蛋白質興味 (受信者) 供与体蛋白質は構造が似ている、理想的には同じタンパク質ファミリーに属するが、読み出しとして使用される生物学的活性を欠いているはずの蛋白質を持つ領域を交換する (ドナー) を選択します。ベクトル配置検索ツール (VAST)14,15などの自動化されたツールを使用して潜在的な候補を識?…
Representative Results
建設とキメラタンパク質 (図 1) の生成は、最近出版された調査6の主題ではなかった OSM と LIF、インターロイキン 6 サイトカイン家族の 2 つのメンバーと例示が。これらのタンパク質の立体構造を図 2に示します。両方の分子は、私 (A ~ D と呼ばれる) 4 つのヘリックスとサイトカインはバンドル パック、ル…
Discussion
キメラ蛋白質の生成は、サイトカイン受容体結合ドメイン13のモジュール性など質問に対処に切り捨てられた蛋白質の限界を超えて移動することができる汎用性の高い技術を構成します。キメラの設計学では、この種の重要なステップであり注意が必要です。機能ドメインを確立する予備研究一般に間必要になります最初の段階で幅広い領域の置換変数の長さより小さい置?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、マックス ・ プランク協会と Schüchtermann クリニック (悪い Rothenfelde、ドイツ) によって支持されました。本研究の一部は、元生物化学のジャーナルで出版されました。エイドリアン ・ Segarra、j. m.、シンドラー、(名)、Gajawada、p.、Lörchner、h.、ブラウン、t. & Pöling、j.AB ループと結合部位 III の人間オンコスタチン M (OSM) の D ヘリックス OSM 受容体活性化のために必要です。J. Biol. chem. 2018;18:7017-7029。 © 著者。
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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Cite This Article
Adrian-Segarra, J. M., Lörchner, H., Braun, T., Pöling, J. Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction. J. Vis. Exp. (143), e58786, doi:10.3791/58786 (2019).