Identification d’une protéine fonctionnelle des régions par le biais de Construction des protéines chimériques
Summary
Protéines de structure apparentées exercent souvent des fonctions biologiques distinctes. L’échange des régions équivalentes de ces protéines afin de créer des protéines chimériques constitue une approche novatrice afin d’identifier les régions critiques de protéines qui sont responsables de leur divergence fonctionnelle.
Abstract
Le but du présent protocole englobe la conception des protéines chimériques dans lequel les régions distinctes d’une protéine sont remplacées par leurs séquences correspondants à une protéine de structure similaire, afin de déterminer l’importance fonctionnelle de ces régions. Ces chimères sont générés au moyen d’un protocole PCR imbriqué à l’aide de fragments d’ADN qui se chevauchent et adéquatement amorces, suivie de leur expression au sein d’un système mammifère indigène structure secondaire et modifications post-traductionnelles.
Le rôle fonctionnel d’une région distincte est alors indiqué par une perte d’activité de la chimère dans un test de lecture appropriée. En conséquence, les régions contenant un ensemble de critiques acides aminés sont identifiées, qui peuvent subir davantage de techniques complémentaires (mutagenèse dirigéepar exemple ) pour augmenter la résolution moléculaire. Bien que limité aux cas dans lesquels on trouvera une protéine structurellement apparentée avec différentes fonctions, protéines chimériques ont été employés avec succès pour identifier les régions de liaison critique en protéines tels que les récepteurs de cytokines et de cytokines. Cette méthode est particulièrement adaptée dans les cas où les régions fonctionnelles de la protéine ne sont pas bien définies et constitue une première étape utile dans les approches d’évolution dirigée à affiner les zones d’intérêt et de réduire l’effort de dépistage impliqué.
Introduction
Plusieurs types de protéines, y compris des cytokines et facteurs de croissance, sont regroupées en familles dont les membres partagent des structures tridimensionnelles similaires mais exercent souvent des fonctions biologiques distinctes1,2. Cette diversité fonctionnelle est généralement la conséquence de petites différences dans la composition en acides aminés au sein active sites3 de la molécule. Identification de ces sites et ces déterminants fonctionnels n’offrent pas de seulement précieux évolutive mais aussi de concevoir des agonistes et des inhibiteurs plus spécifiques4. Cependant, le grand nombre de différences dans la composition de résidus trouvés fréquemment entre les protéines de structure apparentées complique cette tâche. Même si la construction de grandes bibliothèques contenant des centaines de mutants sont de nos jours c’est possibles, évaluer chaque variation seul résidu et combinaisons de ceux-ci reste encore un effort difficile et fastidieux à5.
Techniques d’évaluer l’importance fonctionnelle des protéines grande régions sont donc de valeur afin de réduire le nombre de résidus éventuels à un nombre gérable6. Des protéines tronquées ont été l’approche plus utilisé pour s’attaquer à ce problème. En conséquence, les régions sont réputées être fonctionnellement pertinente si la fonction de la protéine étudiée est affectée par la suppression d’une région donnée7,8,9. Toutefois, une limitation majeure de cette méthode est que destructions peuvent affecter la structure secondaire de la protéine, conduisant à un mauvais repliement, agrégation et l’incapacité pour étudier la région prévue. Un bon exemple est une version tronquée de la cytokine oncostatine M (OSM), dans lequel une délétion interne plus grande que 7 résidus a donné lieu à un mutant mal repliée qui ne pourrait pas être davantage étudié10.
La génération des protéines chimériques constitue une approche alternative et novatrice qui permet l’analyse des plus grandes régions de la protéine. L’objectif de cette méthode consiste à échanger des régions d’intérêt dans une protéine de structure apparentées séquences dans une autre protéine, afin d’évaluer la contribution des sections remplacées à des fonctions biologiques spécifiques. Largement utilisé dans le domaine de la signalisation des récepteurs afin d’identifier les domaines fonctionnels11,12, protéines chimériques sont particulièrement utiles pour l’étude des familles de protéines avec peu acides aminés mais conservé structure secondaire. Des exemples appropriés se trouvent dans la classe des cytokines de type interleukine-6 (IL-6), telles que l’interleukine-6 et ciliaire neurotrophic factor (6 % d’identité)13 ou leucémie facteur inhibiteur (LIF) et (20 % d’identité) OSM6, sur lequel la suivant le protocole est basé.
Protocol
Representative Results
Discussion
La génération des protéines chimériques constitue une technique polyvalente, qui est en mesure d’aller au-delà des limites des protéines tronquées pour répondre aux questions telles que la modularité de cytokine-récepteur liaison domaines13. Le design des chimères est une étape clé dans ce genre d’études et nécessite un examen attentif. Des études préliminaires pour établir des domaines fonctionnels nécessitera généralement substitution de vastes régions dans une premièr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la société Max Planck et la clinique Schüchtermann (Bad Rothenfelde, Allemagne). Cadre de cette recherche a été publiée dans le Journal of Biological Chemistry. Adrian-Segarra, J. M., Schindler, N., Antonino Giuseppe, P., Lörchner, H., Braun, T. & Pöling, J. Les lignes AB et du D-helix en site de liaison III d’humain Oncostatine M (MSO) sont nécessaires pour l’activation des récepteurs OSM. J. Biol. chem., 2018 ; 18:7017-7029. © les auteurs.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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