Chimeric प्रोटीन निर्माण के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान
Summary
संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन अक्सर अलग जैविक कार्यों डालती है । chimeric प्रोटीन बनाने के लिए इन प्रोटीन के समकक्ष क्षेत्रों के आदान-प्रदान के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन क्षेत्रों है कि उनके कार्यात्मक विचलन के लिए जिंमेदार है की पहचान करने के लिए एक अभिनव दृष्टिकोण का गठन किया ।
Abstract
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य chimeric प्रोटीन के डिजाइन जिसमें एक प्रोटीन के विभिंन क्षेत्रों में एक संरचनात्मक रूप से इसी तरह के प्रोटीन में उनके इसी क्रम से बदल रहे हैं, क्रम में इन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व निर्धारित करने के लिए शामिल हैं । इस तरह के chimeras के माध्यम से उत्पन्न कर रहे हैं एक नेस्टेड पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग कर अतिव्यापी डीएनए अंशों और पर्याप्त रूप से डिजाइन प्राइमरों, एक स्तनधारी प्रणाली के भीतर उनकी अभिव्यक्ति के बाद देशी माध्यमिक संरचना और पोस्ट-शोधों संशोधनों को सुनिश्चित करने के लिए.
एक विशिष्ट क्षेत्र की कार्यात्मक भूमिका तो एक उचित readout परख में कल्पना की गतिविधि के नुकसान से संकेत दिया है । परिणाम में, महत्वपूर्ण अमीनो एसिड का एक सेट बंदरगाह क्षेत्रों की पहचान कर रहे हैं, जो आगे पूरक तकनीक द्वारा जांच की जा सकती है (जैसे साइट-निर्देशित mutagenesis) आणविक संकल्प को बढ़ाने के लिए । हालांकि मामलों में जो भिंन कार्यों के साथ एक संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन पाया जा सकता है तक सीमित है, chimeric प्रोटीन सफलतापूर्वक ऐसे साइटोकिंस और cytokine रिसेप्टर्स के रूप में प्रोटीन में महत्वपूर्ण बाध्यकारी क्षेत्रों की पहचान के लिए कार्यरत किया गया है । इस विधि के मामलों में विशेष रूप से उपयुक्त है जिसमें है प्रोटीन कार्यात्मक क्षेत्रों को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं कर रहे हैं, और निर्देशित विकास के दृष्टिकोण में एक मूल्यवान पहले कदम के लिए नीचे ब्याज के क्षेत्रों संकीर्ण और स्क्रीनिंग शामिल प्रयास को कम करने का गठन ।
Introduction
प्रोटीन के कई प्रकार, साइटोकिंस और विकास कारकों सहित, परिवारों में समूहीकृत कर रहे है जिनके सदस्य समान तीन आयामी संरचनाओं का हिस्सा है लेकिन अक्सर अलग जैविक कार्य1,2डालती । इस कार्यात्मक विविधता आमतौर पर है अणु सक्रिय3साइटों के भीतर एमिनो एसिड संरचना में छोटे मतभेदों का परिणाम है । ऐसी साइटों और कार्यात्मक निर्धारकों की पहचान मूल्यवान विकासवादी अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते हैं, लेकिन यह भी अधिक विशिष्ट एगोनिस्ट और अवरोधक4डिजाइन करने के लिए । हालांकि, अक्सर संरचनात्मक रूप से संबंधित प्रोटीन के बीच पाया अवशेषों संरचना में अंतर की बड़ी संख्या इस कार्य पेचीदा । हालांकि म्यूटेंट के सैकड़ों युक्त बड़े पुस्तकालयों का निर्माण आजकल संभव है, हर एक अवशेष भिन्नता का आकलन और उनमें से संयोजन अभी भी एक चुनौतीपूर्ण और समय लेने वाला प्रयास5रहता है.
बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के कार्यात्मक महत्व का आकलन तकनीक मूल्य के इस तरह के एक प्रबंधनीय संख्या6के लिए संभव अवशेषों की संख्या को कम कर रहे हैं । कटा हुआ प्रोटीन इस मुद्दे से निपटने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण किया गया है । तदनुसार, क्षेत्रों के लिए कार्यात्मक प्रासंगिक माना जाता है यदि अध्ययन के तहत प्रोटीन समारोह एक विशेष क्षेत्र7,8,9के विलोपन से प्रभावित है । हालांकि, इस विधि की एक प्रमुख सीमा है कि विलोपन प्रोटीन माध्यमिक संरचना को प्रभावित कर सकते हैं, खुलासा करने के लिए अग्रणी, एकत्रीकरण और इरादा क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए अक्षमता. एक अच्छा उदाहरण है cytokine oncostatin एम (OSM), जिसमें एक आंतरिक विलोपन से बड़ा 7 अवशेषों एक खुलासा उत्परिवर्ती है कि आगे10का अध्ययन नहीं किया जा सकता के परिणामस्वरूप के एक छोटा संस्करण है ।
chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक वैकल्पिक और अभिनव दृष्टिकोण है कि बड़े प्रोटीन क्षेत्रों के विश्लेषण परमिट का गठन किया । इस विधि का लक्ष्य एक प्रोटीन में एक और प्रोटीन में संरचनात्मक रूप से संबंधित अनुक्रम द्वारा ब्याज के क्षेत्रों का आदान प्रदान करने के लिए है, ताकि विशिष्ट जैविक कार्यों के लिए प्रतिस्थापित वर्गों के योगदान का आकलन करने के लिए । व्यापक रूप से संकेत रिसेप्टर्स कार्यात्मक डोमेन11,12की पहचान करने के क्षेत्र में इस्तेमाल किया, chimeric प्रोटीन विशेष रूप से थोड़ा एमिनो एसिड पहचान के साथ प्रोटीन परिवारों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं, लेकिन माध्यमिक संरचना संरक्षित । उपयुक्त उदाहरण interleukin-6 (IL-6) प्रकार साइटोकिंस के वर्ग में पाया जा सकता है, जैसे interleukin-6 और सिलिअरी neurotrophic फैक्टर (6% अनुक्रम पहचान)13 या ल्यूकेमिया निरोधात्मक फैक्टर (लिफ) और OSM (20% पहचान)6, जिस पर निंन प्रोटोकॉल आधारित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
chimeric प्रोटीन की पीढ़ी एक बहुमुखी तकनीक है, जो काट दिया प्रोटीन की सीमा से परे जाने के लिए इस तरह के cytokine रिसेप्टर बाइंडिंग डोमेन13की मॉड्यूलरता के रूप में सवालों के पता करने में सक्षम है का गठन किया…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम मैक्स प्लैंक सोसायटी और Schüchtermann-क्लिनिक (Bad Rothenfelde, जर्मनी) द्वारा समर्थित किया गया था । इस शोध का हिस्सा मूलतः जैव रसायन विज्ञान के जर्नल में प्रकाशित किया गया था । एड्रियन-Segarra, जे. एम., शिंडलर्स, एन., Gajawada, पी., Lörchner, एच., रचाई, टी. & Pöling, जे. अटल बिहारी पाश और डी-मानव Oncostatin एम (OSM) के बंधन साइट III में कुंडल OSM रिसेप्टर सक्रियण के लिए आवश्यक हैं. J. बियोल. २०१८; 18:7017-7029. © द लेखक.
Materials
| Labcycler thermocycler | Sensoquest | 011-103 | Any conventional PCR machine can be employed to carry out this protocol |
| NanoDrop 2000c UV-Vis spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | ND-2000C | DNA quantification |
| GeneRuler 100 bp DNA ladder | ThermoFisher Scientific | SM0241 | |
| GeneRuler DNA Ladder Mix | ThermoFisher Scientific | SM0331 | |
| AscI restriction enzyme | New England Biolabs | R0558 | |
| PacI restriction enzyme | New England Biolabs | R0547 | |
| Phusion Hot Start II DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | F-549S | |
| dNTP set (100 mM) | Invitrogen | 10297018 | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1804 | |
| NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), glycerol stock | ThermoFisher Scientific | MHS6278-202857165 | |
| LE agarose | Biozym | 840004 | |
| Primers | Sigma-Aldrich | Custom order | |
| Human Oncostatin M cDNA | Gift of Dr. Heike Hermanns (Division of Hepatology, University Hospital Würzburg, Germany) | ||
| pCAGGS vector with PacI and AscI restriction sites | Gift of Dr. André Schneider (Max Planck Institute for Heart and Lung Research, Bad Nauheim, Germany) |
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