Espressione e purificazione di TRPC3 la scanalatura del catione del lipido sensibili umani per determinazione strutturale di singola particella cRIO-microscopia elettronica

Calcio è coinvolto nei processi più cellulari tra cui segnalazione cascades, controllo trascrizione, rilascio di neurotrasmettitori e ormoni molecola sintesi^1,2,3. Il mantenimento omeostatico di calcio libero citosolico è cruciale per la salute e la funzione delle cellule. Uno dei principali meccanismi dell’omeostasi intracellulare del calcio è calcio store-operati voce (SOCE), un processo in cui lo svuotamento di calcio memorizzati nei trigger del reticolo endoplasmatico (ER) l’apertura dei canali ionici sulla membrana plasmatica per facilitare la rifornimento di calcio di ER, che può quindi essere utilizzato in ulteriore segnalazione^4,5,6. Canali di potenziale transitorio del ricevitore (TRPC), che sono canali calcio-permeabile della superfamiglia di TRP, sono stati identificati come un partecipante importante SOCE^7,8,9 .

Tra i sette membri della famiglia di TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formano un sottogruppo di omologo, e sono unici nella capacità di essere attivato dal lipido messaggero secondario diacilglicerolo (DAG), un prodotto di degradazione del lipido di segnalazione fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PIP2)^10,11. TRPC3 è altamente espressa nel muscolo liscio e nelle regioni cerebrali e cerebellari del cervello, in cui svolge ruoli essenziali nella segnalazione del calcio che hanno un impatto neurotrasmissione e neurogenesi^12,13. Disfunzione di TRPC3 è stata collegata a disturbi del sistema nervoso centrale, disturbi cardiovascolari e alcuni tipi di cancro come adenocarcinoma ovarico^14,15,16. Pertanto, TRPC3 tiene la promessa come una destinazione farmaceutica per il trattamento di queste malattie. Lo sviluppo di farmaci specificamente mirati che agiscono sul TRPC3 è stato limitato da una mancanza di comprensione dei suoi meccanismi molecolari di attivazione, tra cui lipidica associazione siti^17,18. Abbiamo segnalato la prima struttura di atomico-risoluzione del canale umano di TRPC3 (hTRPC3) e suoi siti di legame di lipido due in uno stato chiuso, fornendo importanti intuizioni questi meccanismi¹⁹.

Il fattore chiave per determinare la struttura di una proteina di membrana ad alta risoluzione è quello di ottenere proteine di alta qualità. La proiezione corrispondente espressione e purificazione condizioni necessarie per ottenere proteine di alta qualità può essere uno sforzo lungo e oneroso. Qui presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio come identificare le condizioni ottimali per l’espressione e purificazione di hTRPC3, che si è comportato male in nostro screening iniziale. Vi presentiamo alcuni punti chiave su come risolvere i problemi e ottimizzare il comportamento della proteina, che pongono una solida base per il nostro cryo-elettrone studi di microscopia (cryo-EM). Usiamo un baculovirus modificate generando vettoriale (pEG), sviluppato da Gouaux e colleghi, che è ottimizzato per lo screening di analisi e generazione efficiente di baculovirus in cellule di mammifero²⁰. Questo metodo di espressione è appropriato per rapido ed economico iperespressione delle proteine nella membrana delle cellule dei mammiferi. Uniamo l’utilizzo di questo vettore con una rilevazione della fluorescenza esclusione basata su cromatografia (FSEC) prescreening metodo²¹. Questo metodo utilizza un tag di proteina fluorescente verde (GFP) fuso al costrutto di interesse e migliora la visualizzazione della proteina dell’obiettivo in piccole, cellule intere campioni solubilizzati. Questo permette per lo screening della stabilità proteica in presenza di diversi detergenti e additivi, con mutazioni di thermostabilizing e permette l’uso di un piccolo numero di cellule dalla trasfezione transiente in piccola scala. In questo modo, una moltitudine di condizioni può essere rapidamente proiettata prima di passare ad una purificazione di proteine su larga scala. A seguito di espressione, lo screening e la purificazione, presentiamo un protocollo per ottenere ed elaborare immagini da cryo-EM per generare una de novo determinazione strutturale della proteina. Noi crediamo che gli approcci descritti qui servirà come un protocollo generalizzabile per studi strutturali di recettori canale TRP e altre proteine di membrana.