Expresión y purificación de los humanos sensibles a lípido catiónico canal TRPC3 para la determinación estructural por microscopia del Cryo-electrón de solo-partícula
Summary
Este protocolo describe las técnicas utilizadas para determinar las estructuras de canal de iones por microscopia del cryo-electrón, incluyendo un sistema de baculovirus para expresar eficientemente genes en células de mamíferos con el mínimo esfuerzo y toxicidad, extracción de proteínas, purificación, y comprobación de la calidad, preparación de la red muestra y proyección, así como recopilación de datos y procesamiento.
Abstract
Canales de potencial receptor transitorio (TRPCs) de la subfamilia TRP canónica son canales de cationes no selectivos que juegan un papel esencial en la homeostasis del calcio, entrada de calcio particularmente tienda que funciona, que es fundamental para mantener el funcionamiento adecuado del liberación de la vesícula sináptica y vías de señalización intracelular. Por consiguiente, los canales TRPC han sido implicados en una variedad de enfermedades incluyendo las enfermedades cardiovasculares como la hipertrofia cardiaca, trastornos neurodegenerativos como la enfermedad de Parkinson y trastornos neurológicos como la ataxia espinocerebelosa. Por lo tanto, canales TRPC representan una diana potencial farmacológica en las enfermedades humanas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de bloquear estos canales aún no están claros. La dificultad en la obtención de grandes cantidades de proteína purificada, homogénea y estable ha sido un factor limitante en los estudios de determinación de estructura, particularmente para las proteínas de membrana mamíferos como los canales de ion TRPC. Aquí, presentamos un protocolo para la expresión a gran escala de proteínas de la membrana del canal de ion mamíferos utilizando un sistema de transferencia de genes de baculovirus modificados y la purificación de estas proteínas por afinidad y cromatografía por exclusión de tamaño. Además, presentamos un protocolo para recoger imágenes de microscopia del cryo-electrón de solo-partícula de proteína purificada y utilizar estas imágenes para determinar la estructura de la proteína. Determinación de la estructura es un método eficaz para la comprensión de los mecanismos de control y función de canales iónicos.
Introduction
Calcio está implicado en procesos celulares más que incluyen señalización cascadas, control de la transcripción, liberación de neurotransmisor y hormona molécula síntesis1,2,3. El mantenimiento homeostático del calcio libre citosólico es crucial para la salud y la función de las células. Uno de los principales mecanismos de homeostasis del calcio intracelular es la entrada de la tienda que funciona de calcio (SOCE), un proceso en el que agotamiento de calcio almacenado en los provocadores de la retículo endoplásmico (ER) la apertura de canales iónicos en la membrana plasmática para facilitar la reposición de calcio ER, que puede utilizarse en la señalización más4,5,6. Canales potencial receptor transitorio (TRPCs), que son permeables al calcio canales pertenecientes a la superfamilia TRP, se han identificado como un importante participante en SOCE7,8,9 .
Entre los siete miembros de la familia TRPC, TRPC3, TRPC6 y TRPC7 forman un subgrupo de homólogo, y son únicos en la capacidad de ser activado por el lípido secundaria mensajero diacilglicerol (DAG), un producto de degradación de los lípidos señalización fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2)10,11. TRPC3 es altamente expresada en el músculo liso y en las regiones cerebrales y cerebelosas del cerebro, donde desempeña funciones esenciales en la señalización de calcio que afectan a la neurotransmisión y neurogénesis12,13. Disfunción de TRPC3 se ha relacionado con trastornos del sistema nervioso central, enfermedades cardiovasculares y ciertos cánceres como el adenocarcinoma ovárico14,15,16. Por lo tanto, TRPC3 es prometedor como objetivo farmacéutico para el tratamiento de estas enfermedades. El desarrollo de fármacos específicamente dirigidos en TRPC3 ha sido limitado por la falta de comprensión de sus mecanismos de activación molecular, incluyendo lípidos vinculante sitios17,18. Hemos reportado la primera estructura de la atómico-resolución del humano TRPC3 canal (hTRPC3) y sus sitios de unión de lípidos dos en un estado cerrado, proporciona penetraciones importantes en estos mecanismos19.
El factor clave para determinar la estructura de una proteína de membrana de alta resolución es obtener proteína de alta calidad. La proyección correspondiente de la expresión y purificación de las condiciones necesarias para obtener proteína de alta calidad puede ser un esfuerzo costoso y desperdiciador de tiempo. Aquí presentamos un protocolo que describe en detalle cómo identificar las condiciones óptimas para la expresión y purificación de hTRPC3, que se comportaron mal en nuestro análisis inicial. Presentamos varios puntos claves acerca de cómo solucionar problemas y optimizar el comportamiento de la proteína, que pone una fundación sólida para la cryo-electrón de estudios de la microscopia (cryo-EM). Utilizamos un baculovirales modificada generación de vectores (pEG), desarrollado por Gouaux y colegas, que se ha optimizado para la detección del análisis y eficiente generación de baculovirus en células de mamífero de20. Este método de expresión es apropiado para la rápida y rentable la sobreexpresión de proteínas en la membrana de la célula mamífera. Combinamos el uso de este vector con una tamaño-exclusión de fluorescencia-detección basada en cromatografía (FSEC) preselección método21. Este método utiliza una etiqueta de la proteína verde fluorescente (GFP) sobre el constructo de interés y mejora la visualización de la proteína objetivo en pequeños celulares solubilizadas las muestras. Esto permite la proyección de la estabilidad de la proteína en presencia de diferentes detergentes y aditivos, con mutaciones de thermostabilizing y permite el uso de un pequeño número de células de transfección transitoria en pequeña escala. De esta manera, una multitud de condiciones puede someterse rápidamente antes de pasar a una purificación de proteínas a gran escala. Expresión, detección y purificación, presentamos un protocolo de obtención y procesamiento de imágenes de cryo-EM para generar una determinación estructural de novo de la proteína. Creemos que los enfoques descritos aquí servirá como un protocolo generalizable para estudios estructurales de TRP canales receptores y otras proteínas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinación estructural de proteínas por cryo-EM ha revolucionado el campo de la biología estructural en los últimos años, gracias al desarrollo de nuevas cámaras y algoritmos que acelera significativamente la determinación de la estructura de las proteínas que no cristalizar fácilmente, particularmente las proteínas de la membrana. A pesar de los avances recientes en la técnica de cryo-EM, la preparación de proteínas purificadas en calidad y cantidad suficiente para facilitar la calidad de imagen a menudo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Zhao G. y X. Meng por el apoyo con la recopilación de datos en David Van Andel avanzado Cryo-Electrón microscopia Suite. Agradecemos el equipo VARI High-Performance Computing para soporte computacional. Damos nuestro agradecimiento a Floramo de J. Clemente, cuotas de D., N. Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth y Z. Ruan por comentarios que mejoraron grandemente este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoyo editorial para este manuscrito. Este trabajo fue apoyado por VARI interna financiación.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
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