Выражение и очищение человека липидов чувствительных катионного канала TRPC3 структурные определения по одной частицы крио электронная микроскопия

Кальций участвует в самых клеточных процессах, включая сигнальные каскады, транскрипция управления, нейромедиатора релиз и гормон молекулы синтез^1,2,3. Гомеостатических поддержание цитозольной свободного кальция имеет решающее значение для здоровья и функции клеток. Одним из основных механизмов гомеостаза внутриклеточного кальция является запись работает магазин кальция (SOCE), процесс, в котором истощения кальция хранится в эндоплазматический ретикулум (ER) триггеры открытие ионных каналов на плазматической мембраны для облегчения пополнение ER кальция, который затем может использоваться в дальнейшей сигнализации^4,5,6. Переходный рецепторный потенциал каналов (TRPCs), которые кальция проницаемые каналы, принадлежащие ГТО надсемейства, были определены как одним из основных участников в SOCE^7,8,9 .

Среди семи членов в семье Термизатор TRPC3, TRPC6 и TRPC7 образуют подгруппу гомолог, и они являются уникальными в способности быть активированы липидов вторичных посланник диацилглицерол (ГПДР), продуктом разложения сигналов липидов фосфатидилинозитол 4,5-Бисфосфат (PIP2)^10,11. Высоко TRPC3 выражается в гладких мышц и регионах мозга и мозжечка головного мозга, где он играет существенную роль в сигнализации кальция, которые влияют синапсах и нейрогенез^12,13. Дисфункция TRPC3 были связаны с центральной нервной системы, сердечно-сосудистых заболеваний и некоторых видов рака, таких как аденокарцинома яичников^14,,1516. Таким образом TRPC3 обещает как фармацевтического назначения для лечения этих заболеваний. Разработка целенаправленных препараты, действующие на TRPC3 было ограничено отсутствием понимания его молекулярной активации механизмов, включая липидов привязки сайтов^17,18. Мы сообщили первой атомной резолюции структуры человеческого TRPC3 канал (hTRPC3) и ее две липидов привязки сайтов в закрытом состоянии, предоставляя важные выводы этих механизмов¹⁹.

Ключевым фактором для определения структуры мембранный белок с высоким разрешением, чтобы получить белка высокого качества. Соответствующие скрининг очистки и выражение условия, необходимые для получения высококачественного белка может быть длительным и дорогостоящим стремиться. Здесь мы представляем протокол, подробно описывающий, как мы определить оптимальные условия для выражения и очистки hTRPC3, который вел себя плохо в наших первоначальных скрининг. Мы представляем несколько ключевых моментов, о том, как оптимизировать поведение белка, который заложить прочную основу для нашей крио электронная микроскопия (крио ЭМ) исследования и устранения неполадок. Мы используем модифицированных baculoviral генерации вектор (ПЭГ), разработанный Gouaux и коллеги, который оптимизирован для скрининговых анализов и эффективного поколения бакуловирусы в mammalian клетках²⁰. Это выражение метод подходит для быстрого и экономически гиперэкспрессия белков в млекопитающих клеточной мембраны. Мы совмещаем использование данного вектора с флуоресцентным обнаружением размер исключение на основе хроматографии (FSEC), подавшим метод²¹. Этот метод использует тег Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), сливается с конструкцией интерес и улучшает визуализацию целевого белка в небольших, поклеточного растворимых образцов. Это позволяет для проверки стабильности белка в присутствии различных моющих средств и добавок, с thermostabilizing мутации и позволяет использовать небольшое количество клеток от небольших переходных transfection. Таким образом множество условий может проверяться быстро до переезда в крупномасштабных белка очистки. После выражения, скрининг и очистки мы представляем собой протокол для получения и обработки изображений с крио EM для создания de novo определение структурного белка. Мы считаем, что подходы, описанные здесь будет служить обобщаемым протокол для структурных исследований ГТО канал рецепторов и других мембранных белков.