Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron
Summary
Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.
Abstract
Transiente do receptor potencial canais (TRPCs) da subfamília TRP canônica são canais de cátion não seletivo que desempenham um papel essencial na homeostase do cálcio, entrada de cálcio particularmente operada a loja, que é fundamental para manter a função adequada de lançamento da vesícula sináptica e vias de sinalização intracelulares. Por conseguinte, canais TRPC têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo distúrbios cardiovasculares, tais como hipertrofia cardíaca, doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson e distúrbios neurológicos como ataxia espinocerebelar. Portanto, canais TRPC representam um potencial alvo farmacológico em doenças humanas. No entanto, os mecanismos moleculares de gating nesses canais são ainda pouco claras. A dificuldade na obtenção de grandes quantidades de proteína purificada, homogênea e estável tem sido um fator limitante em estudos de determinação de estrutura, particularmente para proteínas de membrana de mamíferos como os canais de íon TRPC. Aqui, apresentamos um protocolo para a expressão em larga escala de proteínas de membrana de canal íon mamíferos usando um sistema de transferência do gene de baculovirus modificados e a purificação destas proteínas por afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho. Apresentamos mais um protocolo para coletar imagens de microscopia cryo-elétron da único-partícula de proteína purificada e usar estas imagens para determinar a estrutura da proteína. Determinação da estrutura é um método poderoso para compreender os mecanismos de retenção e função em canais iônicos.
Introduction
Cálcio está envolvido em processos mais celulares, incluindo a sinalização, cascatas, controle de transcrição, liberação de neurotransmissor e hormônio molécula síntese1,2,3. A manutenção homeostática do cálcio citosólico livre é crucial para a saúde e a função das células. Um dos principais mecanismos de homeostase de cálcio intracelular é operada a loja cálcio entrada (SOCE), um processo no qual depleção de cálcio armazenado em disparadores o retículo endoplasmático (ER) a abertura de canais iônicos na membrana plasmática, para facilitar a reposição de cálcio ER, que pode ser usado na sinalização mais4,5,6. Canais potencial receptor transitória (TRPCs), que são canais de cálcio-permeável pertencentes à Superfamília TRP, identificaram-se como um participante importante em SOCE7,8,9 .
Entre os sete membros da família TRPC, TRPC3, TRPC6 e TRPC7 formam um subgrupo homólogo, e eles são únicos na habilidade de ser ativado pelo Mensageiro secundário lipídico diacilglicerol (DAG), um produto de degradação de lipídios a sinalização fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2)10,11. TRPC3 é altamente expresso no músculo liso e nas regiões do cérebro, onde ele tem um papel essencial na sinalização de cálcio que afetam a neurotransmissão e neurogênese12,13cerebrais e cerebelares. Disfunção de TRPC3 tem sido associada a distúrbios do sistema nervoso central, distúrbios cardiovasculares e certos tipos de câncer como adenocarcinoma ovariano14,15,16. Portanto, TRPC3 é uma promessa como um destino de farmacêutico para o tratamento destas doenças. Desenvolvimento de fármacos direcionados especificamente atuando na TRPC3 tem sido limitado pela falta de compreensão de seus mecanismos de ativação molecular, incluindo lipídios vinculação sites17,18. Informamos a primeira estrutura atômica-resolução do canal de TRPC3 humano (hTRPC3) e os seus sítios de ligação de lipídios dois em um estado fechado, proporcionando insights importantes sobre esses mecanismos de19.
O fator chave para determinar a estrutura de uma proteína de membrana em alta resolução é obter proteína de alta qualidade. O rastreio correspondente de expressão e purificação de condições necessárias para obter a proteína de alta qualidade pode ser uma tarefa demorada e dispendiosa. Aqui nós apresentamos um protocolo descrevendo em detalhe como identificamos as condições ideais para a expressão e purificação de hTRPC3, que se comportou mal na nossa seleção inicial. Apresentamos vários pontos-chave sobre como solucionar problemas e otimizar o comportamento da proteína, que colocam uma base sólida para nossa cryo-elétron estudos de microscopia (cryo-EM). Nós usamos um baculoviral modificado gerando vetor (pEG), desenvolvido pela Gouaux e colegas, que é otimizado para a seleção de ensaios e eficiente geração de baculovirus em células de mamíferos,20. Este método de expressão é apropriado para rápida e econômica a superexpressão de proteínas na membrana celular dos mamíferos. Podemos combinar o uso deste vetor com uma tamanho de fluorescência-deteção-exclusão baseada em cromatografia (FSEC) prescreening método21. Esse método usa uma tag de proteína verde fluorescente (GFP) fundida-se para a construção de interesse e melhora a visualização da proteína alvo em amostras pequenas, células inteiras de solubilizado. Isto permite a análise de estabilidade de proteína na presença de diferentes detergentes e aditivos, com mutações thermostabilizing e permite o uso de um pequeno número de células de transfecção transiente em pequena escala. Desta forma, uma infinidade de condições pode ser rastreada rapidamente antes de se mudar para uma purificação de proteínas em larga escala. Após a triagem, expressão e purificação, apresentamos um protocolo para obtenção e processamento de imagens de cryo-EM gerar uma determinação estrutural de novo da proteína. Acreditamos que as abordagens descritas aqui vão servir como um protocolo generalizável para estudos estruturais de receptores de canal TRP e outras proteínas de membrana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Determinação estrutural de proteínas por cryo-EM tem revolucionado o campo da biologia estrutural nos últimos anos, graças ao desenvolvimento de novas câmeras e algoritmos que acelera significativamente a determinação da estrutura das proteínas que não prontamente crystalize, particularmente as proteínas da membrana. Apesar de todos os avanços recentes na técnica de cryo-EM, a preparação de proteínas purified em qualidade e quantidade suficiente para facilitar a alta qualidade de imagem muitas vezes conti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos G. Zhao e X. Meng o apoio com coleta de dados para o David Van Andel Cryo-elétron microscopia conjunto avançado. Agradecemos a equipe VARI de computação de alto desempenho para suporte computacional. Nós damos nossa gratidão a s. Clemente, D. dívidas, J. Floramo, Y. Huang, Y. Kim, C. Mueller, B. Roth e Ruan z para comentários que melhoraram muito este manuscrito. Agradecemos a D. Nadziejka de apoio editorial para este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pela VARI interno financiamento.
Materials
| pEG BacMam vector (pFastBacI) | addgene | 31488 | |
| DH10α cells | Life Technologies | 10361-012 | |
| S.O.C. media | Corning | 46003CR | for transformation of DH10α cells for Bacmid |
| Bacmam culture plates | Teknova | L5919 | for culture of transformed DH10α cells |
| Incubation shaker for bacterial cells | Infors HT | Multitron standard | |
| Incubated orbital shaker for insect cells | Thermo-Fisher | SHKE8000 | |
| Reach-in CO2 incubator for mammalian cells | Thermo-Fisher | 3951 | |
| Table-top orbital shaker | Thermo-Fisher | SHKE416HP | used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells |
| Incubator | VWR | 1535 | for bacterial plates |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | for plasmid extraction and purification |
| Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol | Invitrogen | 15593031 | for DNA extraction |
| Sf9 cells | Life Technologies | 12659017 | insect cells for producing virus |
| Sf-900 media | Gibco | 12658-027 | insect cell media |
| FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cellfectin II | Gibco | 10362100 | for transfecting insect cells |
| lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-027 | for transfecting mamalian cells |
| 0.2 mm syringe filter | VWR | 28145-501 | for filtering P1 virus |
| 0.2 mm filter flasks 500ml resevoir | Corning | 430758 | for filtering P2 virus |
| erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) | Gene Mate | F-5909-2000 | for culturing insect cells |
| erlenmeyer culture flask (baffled 2L) | Gene Mate | F-5909-2000B | for culturing mammalian cells |
| nanodrop 2000 spectrophotometer | Thermo-Fisher | ND-2000 | for determining DNA and protein concentrations |
| HEK293 | ATCC | CRL-3022 | mammalian cells for producing protein |
| Freestyle 293 expression Medium | Gibco | 1238-018 | mammalian cell media for protein expression |
| Butyric Acid Sodium Salt | Acros | 263195000 | to amplify protein expression |
| PMSF | Acros | 215740500 | protease inhibitor |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A1153-100MG | protease inhibitor |
| Leupeptin hydrochloride | Sigma-Aldrich | 24125-16-4 | protease inhibitor |
| pepstatin A | Fisher Scientific | BP2671-250 | protease inhibitor |
| digitonin | EMD Millipore | 300410 | detergent – to solubilize protein from membrane |
| imidazole | Sigma | 792527 | to elute protein from resin column |
| TALON resin | Clonetech | 635504 | for affinity purification by His-tag |
| superose6 incease columns | GE | 29091596; 29091597 | for HPLC and FPLC |
| Prominence Modular HPLC System | Shimadzu | See Below | |
| Controller Module | " | CBM20A | |
| Solvent Delivery System | " | LC30AD | |
| Fluorescence Detector | " | RF20AXS | |
| Autosampler with Cooling | " | SIL20ACHT | |
| Pure FPLC System with Fractionator | Akta | ||
| thrombin (alpha) | Haematologic Technologies Incorporated | HCT-0020 Human alpha | for cleaving GFP tag |
| Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube | Millipore | UFC910008 | for concentrating protein |
| EDTA | Fisher | E478500 | for stabilizing protein |
| 400 mesh carbon-coated copper grids | Ted Pella Inc. | 01754-F | grids for negative stain |
| Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) | Electron Microscopy Sciences | Q3100AR1.3 | grids for Cryo-EM |
| Vitrobot Mark III | FEI | for preparing sample grids by liquid ethane freezing | |
| liquid nitrogen | Dura-Cyl | UN1977 | |
| ethane gas | Airgas | UN1035 | |
| Solarus Plasma System | Gatan | Model 950 | for cleaning grids before sample freezing |
| Tecnai Spirit electron microscope | FEI | for negative stain EM imaging | |
| Talos Arctica electron microsocope | FEI | for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids | |
| Titan Krios electron microscope | FEI | for high-resolution Cryo-EM imaging | |
| Software | |||
| Gautomatch software | http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ | to pick particles from micrographs | |
| Relion 2.1 software | https://github.com/3dem/relion | to construct 2D and 3D classification | |
| CryoSPARC software | https://cryosparc.com/ | to generate an initial structure model | |
| Frealign software | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | to refine particles | |
| Coot software | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | to build a model | |
| MolProbity software | http://molprobity.biochem.duke.edu/ | to evaluate the geometries of the atomic model | |
| SerialEM software | http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ | for automated serial image stack acquisition | |
| MortionCor2 software | http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html | for motion correction of summed movie stacks | |
| GCTF software | https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ | for measuring defocus values in movie stacks | |
| Phenix.real_space_refine software | https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html | for real space refinement of the initial 3D model |
References
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
- Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
- Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
- Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
- Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
- Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
- Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
- Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
- Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
- Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
- Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
- Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
- Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
- Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
- Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
- Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
- Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
- Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
- Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
- Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
- Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
- Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
- Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
- Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
- Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
- Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
- Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
- Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).
