JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

Published: January 07, 2019
doi:
10.3791/58754
, , , , ,
1Van Andel Institute, 2Vollum Institute, 3Janelia Research Campus

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

Abstract

ערוצי פוטנציאלי קולטן ארעי (TRPCs) תת TRP הקנוני הם ערוצים הקטיון nonselective לשחק תפקיד חיוני הומאוסטזיס סידן, ערך סידן במיוחד המופעלים על החנות, אשר חיוני לשמירה על תפקוד תקין של שלפוחית סינפטית שחרור, תאיים איתות המסלולים. בהתאם לכך, ערוצי TRPC היו מעורבים במגוון רחב של מחלות האדם כולל מחלות לב וכלי דם כגון היפרטרופיה, הפרעות ניווניות כגון מחלת פרקינסון, הפרעות רגשיות ונוירולוגיות כגון אטקסיה spinocerebellar. לכן, ערוצי TRPC מייצגים יעד פוטנציאליים תרופתי למחלות אנושיות. עם זאת, המנגנון המולקולרי של gating בערוצים אלה עדיין אינם ברורים. הקושי בהשגת כמויות גדולות של חלבונים מטוהרים, הומוגני ויציב כבר גורם מגביל במחקרים נחישות מבנה, במיוחד עבור ממברנה יונקים חלבונים כגון תעלות היונים TRPC. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הביטוי בקנה מידה גדול של יון בתרבית של ערוץ קרום חלבונים באמצעות מערכת העברת הגן ששונה baculovirus ולטיהור חלבונים אלה על-ידי זיקה ו כרומטוגרפיה גודל-הדרה. בהמשך נציג פרוטוקול כדי לאסוף יחיד-חלקיקים הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ תמונות של חלבון מטוהרים וכדי להשתמש בתמונות אלה כדי לקבוע את מבנה החלבון. מכשור לקביעת קשיות ומבנה היא שיטה עוצמה להבנת המנגנונים של gating ותפקוד בתוך תעלות יונים.

Introduction

סידן מעורב תהליכים תאיים ביותר כולל איתות אשדים, בקרת שעתוק, שחרור נוירוטרנסמיטר והורמון מולקולה סינתזה1,2,3. קיום cytosolic סידן חינם homeostatic חיוני הבריאות והתפקוד של תאים. אחד המנגנונים העיקריים של הומאוסטזיס סידן תאיים הוא סידן המופעלים באמצעות החנות כניסה (SOCE), תהליך שבו דלדול של הסידן מאוחסנים הגורמים המפעילים (ER) רשתית תוך-פלזמית פתיחת תעלות היונים על קרום פלזמה כדי להקל חידוש מלאי של מיון סידן, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש עוד איתות4,5,6. קולטן ארעי פוטנציאליים ערוצים (TRPCs), אשר ערוצי סידן-חדיר השייכים superfamily TRP, זוהו כמשתתף העיקריים ב- SOCE-7,–8,–9 .

בין חברי שבע ממשפחת TRPC, TRPC3, TRPC6 ו- TRPC7 ליצור קבוצת homologue, והם ייחודי ביכולת להיות מופעל על ידי השומנים שליח משני diacylglycerol (DAG), תוצר השפלה של השומנים איתות phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2)10,11. TRPC3 מתבטאת מאוד שריר חלק, האזורים במוח, אסטרוציטומה של המוח, שבו היא משחקת תפקידים חיוניים ב סידן איתות להשפיע12,עצבית ו נוירוג’נסיס13. תפקוד לקוי של TRPC3 נקשר במערכת העצבים המרכזית, מחלות לב וכלי דם, סרטן מסוימים כגון אדנוקרצינומה השחלות14,15,16. לכן, TRPC3 טומן בחובו הבטחה כמטרה תרופות לטיפול במחלות אלה. הפיתוח של תרופות ממוקדות במיוחד על TRPC3 היה מוגבל בשל חוסר ההבנה של מנגנונים הפעלה המולקולרי שלה, כולל השומנים איגוד אתרי17,18. אנחנו מדווחים על המבנה האטומי ברזולוציה הראשון של הערוץ TRPC3 האנושית (hTRPC3) ואתרי שלה מחייב ליפיד שתי במצב סגור, לספק תובנות חשובות אלה מנגנונים19.

גורם מפתח לקביעת המבנה של חלבון ממברנה ברזולוציה גבוהה הוא לקבל חלבון באיכות גבוהה. ההקרנה המתאימים של ביטוי וטיהור התנאים הדרושים לקבל חלבון איכותי יכול להיות מאמץ זמן רב ויקרות. כאן אנו מציגים פרוטוקול המתארת בפירוט כיצד אנו מזהים את תנאים אופטימליים כדי להפוך את הביטוי טיהור של hTRPC3, אשר התנהגה בצורה עלובה ההקרנה הראשונית שלנו. אנו מציגים מספר נקודות מפתח כיצד לפתור בעיות ולמטב את ההתנהגות חלבון, אשר בסיס יציב שלנו הקפאה-האלקטרון מיקרוסקופ (הקפאה-EM) מחקרים. אנו משתמשים baculoviral שונה של יצירת וקטור (pEG), שפותחה על ידי Gouaux ועמיתיו, אשר ממוטב עבור הקרנה מבחני והפקת יעיל baculovirus תאים בתרבית של20. שיטה זו ביטוי מתאים ביטוי מהירה וחסכונית של חלבונים קרום התא יונקים. אנו משלבים את השימוש הזה וקטור עם זריחה-זיהוי גודל-הדרה מבוססי וואקום (FSEC) prescreening שיטת21. שיטה זו משתמשת תג חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) דבוקה הבונה של עניין ומשפר ויזואליזציה של החלבון היעד בדגימות solubilized קטן, כל תא. זה מאפשר להקרנה של חלבון יציבות בנוכחות חומרי ניקוי שונים, תוספים, עם מוטציות thermostabilizing, והוא מאפשר השימוש של מספר קטן של תאים תקנים ארעי בקנה מידה קטן. בדרך זו, מספר רב של מצבים יכולים להיות במהירות מוקרן לפני שעבר הוא לטיהור חלבון בקנה מידה גדול. בעקבות הביטוי, סינון, טיהור, אנו מציגים פרוטוקול קבלת ועיבוד תמונות מהקפאה-EM כדי להפיק את נחישות דה נובו מבנית של החלבון. אנו מאמינים כי הגישות המתוארות כאן ישמש פרוטוקול להכליל ללימודי מבנית של קולטנים ערוץ TRP וחלבונים אחרים ממברנה.

Protocol

1. שינוי של תאים המוסמכת DH10α כדי לייצר Bacmid דנ א לסנתז את הגן עניין, subclone אותו לתוך גרסה מותאמת של וקטור פג המכיל טווין דלקת-תג, תג His8 וכן GFP עם אתר המחשוף תרומבין בקו ה N טרמינוס (pFastBacI)20. להפוך תאים המוסמכת על-ידי הוספת 5 ננוגרם של פלסמיד המכיל גנים הרצוי ב- pFastBacI כדי μL 50 של…

Representative Results

סקירה סכמטי של הפרוטוקול עבור הביטוי ולטיהור hTRPC3 מוצג איור 1A. תמונה של hTRPC3 bacmid לצלחת עם מושבות לבן אידיאלי, הדומה זה שנבחר עבור טיהור DNA bacmid, מוצג איור 1B. . מצאנו שאת 48 שעות הוא אידיאלי עבור Bluo-גל ברור מכתים תוך שמירה על הנוכחות של מושבות המבו?…

Discussion

קביעת מבנה של חלבונים על ידי הקפאה-EM יש מהפכה בתחום ביולוגיה מבנית בשנים האחרונות, בזכות הפיתוח של מצלמות חדשות ואלגוריתמים המזרזת באופן משמעותי את קביעת מבנה של חלבונים שאינם ברצון crystalize, במיוחד קרום חלבונים. למרות כל התפתחויות אחרונות טכניקת הקפאה-EM, הכנת מספקות איכות וכמות מטוהרים חלב?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים ג’י זאו, אקס מנג לתמיכה באיסוף נתונים ב דוד ואן אנדל מתקדם הקפאה-אלקטרון מיקרוסקופ Suite. אנו מעריכים את הקבוצה VARI מחשוב עם ביצועים גבוהים עבור תמיכה חישובית. אנחנו נותנים את הכרת התודה שלנו כדי ש קלמנטה, דמי ד, ג’ Floramo, הואנג י’, י’ קים, מולר ג, רוט נולד ב ו צ Ruan עבור הערות השתפרה מאוד כתב היד הזה. אנו מודים Nadziejka ד על העריכה תמיכה כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי VARI פנימי מימון.

Materials

pEG BacMam vector (pFastBacI) addgene 31488
DH10α cells Life Technologies 10361-012
S.O.C. media Corning 46003CR for transformation of DH10α cells for Bacmid
Bacmam culture plates Teknova L5919 for culture of transformed DH10α cells
Incubation shaker for bacterial cells Infors HT Multitron standard
Incubated orbital shaker for insect cells Thermo-Fisher SHKE8000
Reach-in CO2 incubator for mammalian cells Thermo-Fisher 3951
Table-top orbital shaker Thermo-Fisher SHKE416HP used in Reach-in CO2 incubator for mammalian cells
Incubator VWR 1535 for bacterial plates
QIAprep Spin Miniprep Kit Qiagen 27106 for plasmid extraction and purification
Phenol:Chloroform:Isoamyl alcohol Invitrogen 15593031 for DNA extraction
Sf9 cells Life Technologies 12659017 insect cells for producing virus
Sf-900 media Gibco 12658-027 insect cell media
FBS Atlanta Biologicals S11550
Cellfectin II Gibco 10362100 for transfecting insect cells
lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-027 for transfecting mamalian cells
0.2 mm syringe filter VWR 28145-501 for filtering P1 virus
0.2 mm filter flasks 500ml resevoir Corning 430758 for filtering P2 virus
erlenmeyer culture flask (flat bottom 2L) Gene Mate F-5909-2000 for culturing insect cells
erlenmeyer culture flask (baffled 2L) Gene Mate F-5909-2000B for culturing mammalian cells
nanodrop 2000 spectrophotometer Thermo-Fisher ND-2000 for determining DNA and protein concentrations
HEK293 ATCC CRL-3022 mammalian cells for producing protein
Freestyle 293 expression Medium Gibco 1238-018 mammalian cell media for protein expression
Butyric Acid Sodium Salt Acros 263195000 to amplify protein expression
PMSF Acros 215740500 protease inhibitor
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-100MG protease inhibitor
Leupeptin hydrochloride Sigma-Aldrich 24125-16-4 protease inhibitor
pepstatin A Fisher Scientific BP2671-250 protease inhibitor
digitonin EMD Millipore 300410 detergent – to solubilize protein from membrane
imidazole Sigma 792527 to elute protein from resin column
TALON resin Clonetech 635504 for affinity purification by His-tag
superose6 incease columns GE 29091596; 29091597 for HPLC and FPLC
Prominence Modular HPLC System Shimadzu See Below
Controller Module " CBM20A
Solvent Delivery System " LC30AD
Fluorescence Detector " RF20AXS
Autosampler with Cooling " SIL20ACHT
Pure FPLC System with Fractionator Akta
thrombin (alpha) Haematologic Technologies Incorporated HCT-0020 Human alpha for cleaving GFP tag
Amicon Ultra 15 mL 100K centrifugal filter tube Millipore UFC910008 for concentrating protein
EDTA Fisher E478500 for stabilizing protein
400 mesh carbon-coated copper grids Ted Pella Inc. 01754-F grids for negative stain
Quantifoil holey carbon grid (gold, 1.2/1.3 μm size/hole space, 300 mesh) Electron Microscopy Sciences Q3100AR1.3 grids for Cryo-EM
Vitrobot Mark III FEI for preparing sample grids by liquid ethane freezing
liquid nitrogen Dura-Cyl UN1977
ethane gas Airgas UN1035
Solarus Plasma System Gatan Model 950 for cleaning grids before sample freezing
Tecnai Spirit electron microscope FEI for negative stain EM imaging
Talos Arctica electron microsocope FEI for screening and low resolution imaging of Cryo-EM grids
Titan Krios electron microscope FEI for high-resolution Cryo-EM imaging
Software
Gautomatch software http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/ to pick particles from micrographs
Relion 2.1 software https://github.com/3dem/relion to construct 2D and 3D classification
CryoSPARC software https://cryosparc.com/ to generate an initial structure model
Frealign software http://grigoriefflab.janelia.org/frealign to refine particles
Coot software https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ to build a model
MolProbity software http://molprobity.biochem.duke.edu/ to evaluate the geometries of the atomic model
SerialEM software http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/ for automated serial image stack acquisition
MortionCor2 software http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html for motion correction of summed movie stacks
GCTF software https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/ for measuring defocus values in movie stacks
Phenix.real_space_refine software https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html for real space refinement of the initial 3D model
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 517-529 (2003).
  2. Kumar, R., Thompson, J. R. The regulation of parathyroid hormone secretion and synthesis. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (2), 216-224 (2011).
  3. Sudhof, T. C. Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (1), a011353 (2012).
  4. Ong, H. L., de Souza, L. B., Ambudkar, I. S. Role of TRPC Channels in Store-Operated Calcium Entry. Advances in Experimental Medicine and Biology. 898, 87-109 (2016).
  5. Smyth, J. T., et al. Activation and regulation of store-operated calcium entry. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (10), 2337-2349 (2010).
  6. Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiological Reviews. 95 (4), 1383-1436 (2015).
  7. Liu, X., Singh, B. B., Ambudkar, I. S. TRPC1 is required for functional store-operated Ca2+ channels. Role of acidic amino acid residues in the S5-S6 region. Journal of Biological Chemistry. 278 (13), 11337-11343 (2003).
  8. Zhu, X., Jiang, M., Birnbaumer, L. Receptor-activated Ca2+ influx via human Trp3 stably expressed in human embryonic kidney (HEK)293 cells. Evidence for a non-capacitative Ca2+ entry. Journal of Biological Chemistry. 273 (1), 133-142 (1998).
  9. Zhu, X., et al. trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell. 85 (5), 661-671 (1996).
  10. Itsuki, K., et al. Voltage-sensing phosphatase reveals temporal regulation of TRPC3/C6/C7 channels by membrane phosphoinositides. Channels (Austin). 6 (3), 206-209 (2012).
  11. Tang, J., et al. Identification of common binding sites for calmodulin and inositol 1,4,5-trisphosphate receptors on the carboxyl termini of trp channels. Journal of Biological Chemistry. 276 (24), 21303-21310 (2001).
  12. Gonzalez-Cobos, J. C., Trebak, M. TRPC channels in smooth muscle cells. Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 15, 1023-1039 (2010).
  13. Li, H. S., Xu, X. Z., Montell, C. Activation of a TRPC3-dependent cation current through the neurotrophin BDNF). Neuron. 24 (1), 261-273 (1999).
  14. Becker, E. B., et al. Candidate screening of the TRPC3 gene in cerebellar ataxia. Cerebellum. 10 (2), 296-299 (2011).
  15. Kitajima, N., et al. TRPC3 positively regulates reactive oxygen species driving maladaptive cardiac remodeling. Scientific Reports. 6, 37001 (2016).
  16. Yang, S. L., Cao, Q., Zhou, K. C., Feng, Y. J., Wang, Y. Z. Transient receptor potential channel C3 contributes to the progression of human ovarian cancer. Oncogene. 28 (10), 1320-1328 (2009).
  17. Oda, K., et al. Transient receptor potential cation 3 channel regulates melanoma proliferation and migration. Journal of Physiological Sciences. 67 (4), 497-505 (2017).
  18. Xia, M., Liu, D., Yao, C. TRPC3: A New Target for Therapeutic Strategies in Chronic Pain-DAG-mediated Activation of Non-selective Cation Currents and Chronic Pain (Mol Pain 2014;10:43). Journal of Neurogastroenterology and Motility. 21 (3), 445-447 (2015).
  19. Fan, C., Choi, W., Sun, W., Du, J., Lu, W. Structure of the human lipid-gated cation channel TRPC3. Elife. 7, e36852 (2018).
  20. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  21. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay to identify membrane protein expression and crystallization conditions. Structure (London, England: 1993). 20 (8), 1293-1299 (2012).
  22. Zheng, S. Q., et al. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
  23. Zhang, K. Gctf: Real-time CTF determination and correction. Journal of Structural Biology. 193 (1), 1-12 (2016).
  24. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  25. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  26. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  27. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).
  28. Afonine, P. V., et al. Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (Pt 4), 352-367 (2012).
  29. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (Pt 1), 12-21 (2010).
  30. Scheres, S. H. W., Chen, S. Prevention of overfitting in cryo-EM structure determination. Nature Methods. 9 (9), 853-854 (2012).
  31. Scheres, S. H. W. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  32. Grigorieff, N. Frealign: An Exploratory Tool for Single-Particle Cryo-EM. Methods in Enzymology. 579, 191-226 (2016).
  33. Chen, V. B., et al. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
  34. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
  35. Green, E. M., Au, Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. Journal of Visualized Experiments. (117), e54792 (2016).
  36. Mesa, P., Deniaud, A., Montoya, G., Schaffitzel, C. Directly from the source: endogenous preparations of molecular machines. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 319-325 (2013).
  37. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane Protein Assembly into Nanodiscs. FEBS letters. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  38. Winkler, P. A., Huang, Y., Sun, W., Du, J., Lü, W. Electron cryo-microscopy structure of a human TRPM4 channel. Nature. 552, 200-204 (2017).
  39. Autzen, H. E., et al. Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc. Science. 359 (6372), 228-232 (2017).
  40. Guo, J., et al. Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4. Nature. 552 (7684), 205-209 (2017).
  41. Parmar, M., et al. Using a SMALP platform to determine a sub-nm single particle cryo-EM membrane protein structure. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. 1860 (2), 378-383 (2018).
  42. Gulati, S., et al. Detergent-free purification of ABC (ATP-binding-cassette) transporters. Biochemical Journal. 461 (2), 269-278 (2014).

Tags

TRPC3Ion ChannelProtein ExpressionProtein PurificationSingle-particle Cryo-electron MicroscopyHEK293 CellsVirus InfectionSodium ButyrateDetergent SolubilizationSize-exclusion ChromatographyUltracentrifugation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Haley, E., Choi, W., Fan, C., Sun, W., Du, J., Lü, W. Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e58754, doi:10.3791/58754 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image