Ausdruck und Reinigung des menschlichen Lipid-Sensitive kation Kanal TRPC3 für die Strukturaufklärung von Single-Teilchen Kryo-Elektronenmikroskopie

Kalzium ist in die zelluläre Prozesse einschließlich der Signalisierung Kaskaden, Transkription Kontrolle, Neurotransmitter-Freisetzung und Hormon-Molekül Synthese^1,2,3beteiligt. Die homöostatische Wartung der cytosolischen freie Kalzium ist entscheidend für die Gesundheit und Funktion der Zellen. Einer der wichtigsten Mechanismen der intrazellulären Calcium-Homöostase ist Store betrieben Kalzium Eintrag (SOCE), ein Prozess, in dem gespeichert Erschöpfung des Kalziums in das endoplasmatische Retikulum (ER) löst die Öffnung von Ionenkanälen auf der Plasmamembran zu erleichtern, die Auffüllung der ER Kalzium, die dann in weiteren Signalisierung^4,5,6verwendet werden kann. Transienten Rezeptor möglichen Kanäle (TRPCs), die Kalzium-durchlässige Kanäle, die TRP-Superfamilie angehören, wurden als einer der wichtigsten Teilnehmer SOCE^7,8,9 identifiziert.

Unter den sieben Mitgliedern der Familie TRPC TRPC3, TRPC6 und TRPC7 bilden eine Untergruppe homolog, und sie sind einzigartig in der Fähigkeit von Lipid sekundäre Messenger Diacylglycerol (DAG), ein Abbauprodukt von Signalisierung Lipid aktiviert werden Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate (PIP2)^10,11. TRPC3 drückt sich hoch, in glatten Muskulatur und in der zerebralen und zerebelläre Regionen des Gehirns, wo er entscheidende Rolle spielt bei der Signalisierung von Kalzium, die Neurotransmission und Neurogenese^12,13auswirken. Dysfunktion des TRPC3 ist mit Störungen des zentralen Nervensystems, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und bestimmten Krebsarten wie z. B. Eierstock Adenokarzinom^14,15,16verbunden worden. Deshalb verspricht TRPC3 als pharmazeutische Ziel für die Behandlung dieser Krankheiten. Die Entwicklung gezielt Medikamente, die auf TRPC3 wurde durch einen Mangel an Verständnis für die molekulare Aktivierungsmechanismen, einschließlich Lipid Bindung Seiten^17,18beschränkt. Wir haben die erste atomarer Auflösung Struktur des menschlichen TRPC3 Kanals (hTRPC3) und seine zwei Lipid-Bindungsstellen im geschlossenen Zustand berichtet, wichtige Einblicke in diese Mechanismen¹⁹.

Der entscheidende Faktor für die Bestimmung der Struktur eines Proteins Membran mit hoher Auflösung ist Protein von hoher Qualität zu erhalten. Die entsprechenden Screening von Ausdruck und Reinigung Bedingungen notwendig, hochwertiges Eiweiß zu erhalten kann ein Zeit- und kostenaufwendig Unterfangen sein. Hier präsentieren wir ein Protokoll beschreibt im Detail wie ermitteln wir die optimalen Bedingungen für den Ausdruck und die Reinigung des hTRPC3, die in unseren ersten Screening schlecht benommen. Wir präsentieren einige wichtige Punkte zur Problembehandlung und optimieren die Protein-Verhalten, das eine solide Grundlage für unsere Cryo-Elektron Mikroskopie (Cryo-EM) Studien geschaffen. Wir verwenden eine modifizierte Baculoviral Vektor (pEG), entwickelt von Gouaux und Kollegen, die optimiert ist für das screening-Assays und effiziente Erzeugung von Baculovirus in Säugerzellen²⁰generieren. Dieser Ausdruck-Methode eignet sich für schnelle und kostengünstige Überexpression von Proteinen in der Säugetier-Zelle Membrane. Wir kombinieren die Verwendung dieses Vektors mit einem Fluoreszenz-Detektion Größe-Ausschluss Chromatographie-basierte (FSEC) prescreening Methode²¹. Diese Methode verwendet einen grün fluoreszierendes Protein (GFP) Tag verschmolzen, das Konstrukt von Interesse und verbessert die Visualisierung des Zielproteins in kleine, ganze Zelle solubilisiert Proben. Dies ermöglicht für das Screening der Proteinstabilität im Beisein von verschiedenen Wasch- und Zusatzstoffe, mit thermostabilizing Mutationen, und ermöglicht die Verwendung einer kleinen Anzahl von Zellen aus kleinen transiente Transfektion. Auf diese Weise kann eine Vielzahl von Bedingungen rasch untersucht werden, bevor er zu einer groß angelegten Proteinreinigung. Nach Ausdruck, Screening und Reinigung präsentieren wir ein Protokoll für die Beschaffung und Verarbeitung von Bildern von Cryo-EM, eine de-Novo -Strukturaufklärung des Proteins zu generieren. Wir glauben, dass die hier beschriebenen Vorgehensweisen als verallgemeinerbare Protokoll für strukturelle Studien der TRP-Kanal-Rezeptoren und andere Membranproteine dienen werden.