Folat reseptör Beta makrofaj ve dev hücreli arterit vasküler bağışıklık Microenvironment profil için bir Immunohistopathologic çalışma
Summary
Protokol histopatolojik tetkik ve folat reseptör beta makrofaj ve toplam bağışıklık hücre ilişki içinde dev hücreli arterit temporal arter biyopsisi sızmak profiline immünhistokimya kullanımını göstermektedir.
Abstract
Dev hücreli arterit (GCA) büyük yetişkin etkileyen kronik immün aracılı orta-büyük ölçekli arterlerin bir hastalıktır. GCA bildirimleri artrit ve tıkayıcı belirtiler baş ağrısı, kontur veya vizyon kaybı. Makrofajlar ve T-helper lenfositler vasküler duvar sızmak ve gemi hasar ve iskemi neden bir pro-inflamatuar yanıt üretmek. Bugüne kadar hastalık aktivite ve Kılavuzu terapötik yanıt izleyebilirsiniz hiçbir GCA biyomarker olduğunu.
Folat reseptör beta (FRB) hücre zarı üzerinde bağlantılı ve normalde myelomonocytic soy ve myeloid lösemi hücreleri de tümör ve romatoid sinovyal makrofajlar gibi çoğunluğu ifade bir glycosylphosphatidylinositol proteindir, nerede ifadesini hastalık şiddeti ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. FRB folat bileşikleri, folik asit conjugates ve antifolate ilaçlar bağlama yeteneği o kanser ve inflamatuar hastalıkları araştırma druggable bir hedef yaptı. Bu rapor ifade ve GCAimmunopathology ile ilgili olarak FRB dağılımı değerlendirmek için kullanılan histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri açıklar.
Formalin sabit ve parafin gömülü temporal arter biyopsisi GCA ve normal denetimlerin Hematoksilen ve eozin ile doku histolojisi gözden geçirin ve patognomonik olan özellikleri bulmak için lekeli. İmmünhistokimya FRB, CD68 ve CD3 ifade algılamak için kullanıldı. Mikroskopik analiz 10 seçilen yüksek power alanlı bölümler ve ilgili konumlarını arteryel duvardaki olumlu lekeli hücre sayısı ölçmek için gerçekleştirildi.
İntimal hiperplazi tarafından Lymphohistiocytic (LH) inflamasyon eşlik ve kesintiye elastik lamina GCA içinde yok denetimlerde bulunamadı ile görüldü. LH infiltrat yaklaşık % 60 lenfositler ve % 40 makrofajlar oluşmaktadır. FRB ifade toplam CD68 + makrofaj nüfusunun % 31’i oluşan ve medya ve adventitia için yerelleştirilmiş makrofajlar, sınırlı. Hiçbir FRB denetimlerde görüldü.
Bu iletişim kuralı FRB makrofaj vasküler bağışıklık microenvironment GCA içinde göre farklı sayısal ve kayma örnek gösterdi.
Introduction
Dev hücreli arterit (GCA) orta büyük arter, aorta ve dalları hedefleme ve eski yetişkin etkileyen iltihabi bir hastalıktır. Hafif baş ağrısı, çene ağrısı, görme kaybı, kontur ve doku kangren gibi ağır iskemik komplikasyonlara sunar. Tanı eritrosit sedimantasyon hızı (ESR) ve farklı bir histopatolojik desen temporal arter biyopsisi (sekmesi)1gibi yüksek inflamatuar işaretleri tarafından onaylanır. GCA en yaygın yetişkin vaskülit ve tanı için elde edilen temporal arter erişilebilirliğini böylece bir daha kolay onun patogenezi okumaya etkinleştirme diğer vasculopathies üzerinde bir avantaj sunuyor. Tipik bulguları sekmesinde bir infiltrat makrofajlar/histiyosit ve normalde bunlar ayıran elastik lamina eşzamanlı imha ile tunica intima, medya ve adventitia tüm vasküler katmanları arasında bulunan T lenfosit içerir bölmeleri2. Geçerli kanıt GCA vasküler adventitia dendritik hücrelerde etkinleştirir bilinmeyen bir antijen içerdiğini gösterir, yardımcı işe alma tarafından takip T (Th) hücreleri, hangi interlökin-17 salgılar özellikle Th1 ve Th17 alt türlerini ve interferon-gamma (IFG) anılan sıraya göre. IFG sonra acemi ve makrofajlar sitokinler ve proteaz üretmek için etkinleştirir. Bunlar pro-inflamatuar sitokinlerin karşılıklı Th1 hücre böylece pozitif geribesleme sağlamak etkinleştirir IL-12 de dahil olmak üzere; tümör nekroz faktör ve interlökin-6, artrit ve ateş ve metalloproteases neden elastik lamina zarar verebilir. Standart kronik tedavi oluşturan sebepler (GC), kısmen Th17/IL-17 ama değil Th1/bag kol bağışıklık yanıtı3,4inceltiyorum sitokin yolları kontrol. Ne yazık ki, GC kesilmesi hastalığın nüks içinde sonuçlanır. Alternatif bir yöntem olarak metotreksat GCA tedavisinde repurposed ama daha duyarlı biyolojik tedavi izleme5için,6 kullanılmıştır değil, ancak istenen klinik bitiş noktaları sürekli olarak elde edildi değil . Hastalık kontrol ve steroid etkileri7,8tutumlu etkili bir şekilde gösterildiği gibi 2017 yılında, interlökin 6 kütük parçası, tocilizumab, GCA tedavisi için onaylanmıştır.
Bugüne kadar hiçbir iyi biyolojik GCA için vardır. Sonuç olarak, hastalık etkinliğini izlemek ve yan etkileri önlemek ve topluma maliyet yükü azaltmak için kullanılabilir uyuşturucu doz titre zordur. Böylece, bir aday biyomarker hastalık aktivitesi ile ilişkilendirir sağlamak yeni anlayışlar patogenez ve tedavi edici kararlar yardım aramak için zorunludur.
Makrofaj harekete geçirmek bozukluk GCA patogenezinde önemli bir faktördür. Böylece, GCA tedavi için etkili bir yol aktif makrofajlar seçici hedefleme olabilir. Folat reseptör beta (FRB) hücre membran üzerinde bağlantılı bir glikosil-phosphatidylinositol glikoprotein ifade normal myelomonocytic hücrelerde, myeloid lösemi hücreleri ve makrofajlar harekete geçirmek olduğunu. Onun ligand, folik asit, hücresel DNA sentezi, metilasyonu ve onarım9sağlar onun azaltılmış formundaki gerekli bir vitamindir. FRB ifade otoimmün hastalığı ve karsinojenezis sırasında indüklenen. İfadesini solid organ ve myeloid maligniteler10,11,12 monosit veya pro-inflamatuar M1 makrofajlar Romatoid Artritte yüzeyine veya anti-inflamatuar M2 makrofajlar sınırlıdır , 13. bir biyomarker aktif makrofajlar gibi potansiyel rolüne ek olarak, FRB seçici uyuşturucu taşıma başlatmak için folik asit, antifolates veya folat Birleşik ilaçlar hücre reseptör bağlama ile bir çok adımlı işlem aracılığıyla etkinleştirebilirsiniz yüzey, ardından içselleştirilmesi, yayın ve istenen uyuşturucu nihai teslimat iç hücre makine12,14,15,16. Aksine FRB kanser hücrelerinde ifade ve makrofajlar aktif, normal hematopoetik hücrelerin içinde ifade FRB böylece FRB/folat-aracılı ilaç dağıtım FRB pozitif enflamatuar veya kanser hücrelerinin sınırlıdır sağlanması folates bağlamak yapamaz.
Bizim önceki çalışmada FRB GCA makrofajlar içinde ifade edilir ilk kez gösterdi ve ifadesini CD68 + ve endotelin reseptör beta makrofajlar, GCA Patogenez17‘ ye katkıda korelasyon. Bu raporda, tarif biz histopatolojik ve immunohistokimyasal yöntemleri FRB makrofaj değerlendirmek için kullanılan ve toplam lenfosit analiz ve makrofaj GCA vasküler manzara FRB’ın bulunduğu bir anlayış kazanmak için sayar.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA erişkinlerde en sık görülen vaskülit ve onun patolojik hallmark T helper lenfositler güçlü bir kombinasyon örneğidir ve ayrıca diğer granülomatöz hastalıkların ya da sarkoidoz gibi vasculopathies bulunabilir makrofajlar aktif ve granülomatöz polyangiitis2,3. GCA, temporal arter orta-büyük ölçekli arter iyi bir gösterimini sağlar ve böylece ortaya çıkan tanı rolleri çalışma için fırsatlar yaratmak için yıl, parafin blok için…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Dr. Douglas merdiven, Marianne Klinger, Ann Benko, bölünme, Romatoloji/bölümü tıp ve moleküler ve histopatolojik çekirdek laboratuvar, Penn State Üniversitesi Tıp Fakültesi, Hershey PA de desteğiyle mümkün yapıldı
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
- Klippel, J. H., Stone, J. H., White, P. H. . Primer on the rheumatic diseases. , (2008).
- Weyand, C. M., Goronzy, J. J. Immune mechanisms in medium and large-vessel vasculitis. Nature Reviews Rheumatol. 9 (12), 731-740 (2013).
- Weyand, C. M., Liao, Y. J., Goronzy, J. J. The immunopathology of giant cell arteritis: diagnostic and therapeutic implications. Journal of Neuro-ophthalmology. 32 (3), 259-265 (2012).
- Deng, J., Younge, B., Olshen, R., Goronzy, J., Weyand, C. Th17 and Th1 T-cell responses in giant cell arteritis. Circulation. 121, 906-915 (2010).
- Mahr, A. D., et al. Adjunctive methotrexate for treatment of giant cell arteritis: an individual patient data meta-analysis. Arthritis & Rheumatology. 56 (8), 2789-2797 (2007).
- Hoffman, G. S., et al. A multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of adjuvant methotrexate treatment for giant cell arteritis. Arthritis & Rheumatology. 46 (5), 1309-1318 (2002).
- Stone, J. H., Klearman, M., Collinson, N. Trial of Tocilizumab in Giant-Cell Arteritis. New England Journal of Medicine. 377 (15), 1494-1495 (2017).
- Milman, N. Tocilizumab increased sustained glucocorticoid-free remission from giant cell arteritis. Annals of Internal Medicine. 167 (12), JC63 (2017).
- Xia, W., et al. A functional folate receptor is induced during macrophage activation and can be used to target drugs to activated macrophages. Blood. 113 (2), 438-446 (2009).
- Shen, J., et al. Folate receptor-beta constitutes a marker for human proinflammatory monocytes. Journal of Leukocyte Biology. 96 (4), 563-570 (2014).
- Salazar, M. D., Ratnam, M. The folate receptor: what does it promise in tissue-targeted therapeutics. Cancer and Metastasis Reviews. 26 (1), 141-152 (2007).
- Low, P. S., Henne, W. A., Doorneweerd, D. D. Discovery and development of folic-acid-based receptor targeting for imaging and therapy of cancer and inflammatory diseases. Accounts of Chemical Research. 41 (1), 120-129 (2008).
- Puig-Kroger, A., et al. Folate receptor beta is expressed by tumor-associated macrophages and constitutes a marker for M2 anti-inflammatory/regulatory macrophages. 癌症研究. 69 (24), 9395-9403 (2009).
- Nakashima-Matsushita, N., et al. Selective expression of folate receptor beta and its possible role in methotrexate transport in synovial macrophages from patients with rheumatoid arthritis. Arthritis & Rheumatology. 42 (8), 1609-1616 (1999).
- vander Heijden, J. W., et al. Folate receptor beta as a potential delivery route for novel folate antagonists to macrophages in the synovial tissue of rheumatoid arthritis patients. Arthritis & Rheumatology. 60 (1), 12-21 (2009).
- Jansen, G., Peters, G. J. Novel insights in folate receptors and transporters: implications for disease and treatment of immune diseases and cancer. Pteridines. 26 (2), 41-53 (2015).
- Albano-Aluquin, S., Malysz, J., Aluquin, V. R., Ratnam, M., Olsen, N. An immunohistochemical analysis of folate receptor beta expression and distribution in giant cell arteritis – a pilot study. American Journal of Clinical and Experimental Immunology. 6 (6), 107-114 (2017).
- Ross, J. F., Chaudhuri, P. K., Ratnam, M. Differential regulation of folate receptor isoforms in normal and malignant tissues in vivo and in established cell lines. Physiologic and clinical implications. Cancer. 73 (9), 2432-2443 (1994).
- Reiner, N. E. Methods in molecular biology. Macrophages and dendritic cells. Methods and protocols. Preface. Methods in Molecular Biology. 531, (2009).
- Robertson, D., Savage, K., Reis-Filho, J. S., Isacke, C. M. Multiple immunofluorescence labelling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue. BMC Cell Biology. 9, 13 (2008).
- Pawlina, W. . Histology: A text and atlas with correlated cell and molecular biology. , (2016).
- Kumar, V., Abbas, A., Robbins Aster, J. . Robbins and Cotran pathologic basis of disease. , (2015).
- Dabbs, D. J. . Diagnostic immunohistochemistry. , (2019).
- Ross, J. F., et al. Folate receptor type beta is a neutrophilic lineage marker and is differentially expressed in myeloid leukemia. Cancer. 85 (2), 348-357 (1999).
- Holzapfel, G. A., Fratzl, P. Collagen in arterial walls: biomechanical aspects. Collagen. Structure and Mechanics. , 285-324 (2008).
- Sultan, H., Smith, S. V., Lee, A. G., Chevez-Barrios, P. Pathologic Markers Determining Prognosis in Patients with Treated or Healing Giant Cell Arteritis. American Journal of Ophthalmology. , (2018).
