Um estudo de Immunohistopathologic de perfil o folato receptores Beta macrófago e Vascular microambiente imune na arterite de células gigantes
Summary
O protocolo ilustra o uso do exame histopatológico e imuno-histoquímica para perfil o macrófago de beta de receptor de folato e sua relação com a célula total imune infiltrar-se na biópsia da artéria temporal na arterite de células gigantes.
Abstract
Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença crónica, imune-mediada das artérias de tamanhos médio para grande afeta adultos mais velhos. GCA manifestos com artrite e oclusivos sintomas de dores de cabeça, derrame ou perda de visão. Macrófagos e linfócitos T-helper infiltrar a parede vascular e produzem uma resposta pro-inflamatórios que levam a lesão vascular e isquemia. Até à data, não há nenhum biomarcador de GCA que pode monitorar a resposta terapêutica guia e atividade de doença.
Beta de receptor de folato (FRB) é uma proteína de glicosilfostidilinosiol que está ancorada na membrana celular e normalmente expresso na linhagem mielomonocítica e na maioria das células de leucemia mieloide, bem como no tumor e macrófagos sinoviais reumatoides, onde sua expressão se correlaciona com a severidade da doença. A capacidade de FRB vincular compostos de ácido fólico, ácido fólico-conjugados e drogas antifolate tornou um alvo druggable na pesquisa de doenças inflamatórias e câncer. Este relatório descreve os métodos de histopatológico e imuno-histoquímicos utilizados para avaliar a expressão e a distribuição de FRB em relação GCAimmunopathology.
Biópsias de artéria temporal fixada em formol e parafina do GCA e controles normais foram coradas com hematoxilina e eosina, para rever a histologia do tecido e identificar características patognomônicas. Imuno-histoquímica foi usado para detectar a expressão FRB, CD68 e CD3. Uma análise microscópica foi realizada para quantificar o número de células coradas positivamente em 10 seções selecionadas do elevado-poder-campo e seus respectivos locais na parede arterial.
Inflamação Lymphohistiocytic (LH) acompanhado por hiperplasia da íntima e lâmina elástica interrompida foi vista em GCA com nenhum encontrado nos controles. O infiltrado de LH foi composto de aproximadamente 60% macrófagos linfócitos e 40%. FRB expressão era restrito aos macrófagos, composto por 31% da população de macrófagos CD68 + total e localizado para a mídia e adventícia. Não FRB foi visto em controles.
Este protocolo demonstrou um padrão distinto de numérico e espacial do macrófago FRB em relação o microambiente imune vascular em GCA.
Introduction
Arterite de células gigantes (GCA) é uma doença inflamatória das artérias de médio a grande, visando a aorta e seus ramos e afetando adultos mais velhos. Apresenta-se com leve a graves complicações isquêmicas, tais como dores de cabeça, dor no maxilar, perda de visão, acidente vascular cerebral e tecido gangrena. O diagnóstico é confirmado pela altos marcadores inflamatórios como taxa de sedimentação de eritrócitos (ESR) e um padrão distinto de histopatológico na artéria temporal biópsia (TAB)1. GCA é a vasculite mais comum de adulta e a acessibilidade da artéria temporal obtida para o diagnóstico apresenta uma vantagem sobre outros vasculopathies, permitindo que se estude a sua patogênese mais prontamente. Os achados típicos na guia incluem um infiltrado de histiócitos/macrófagos e linfócitos T, encontrados em todas as camadas vasculares da túnica íntima, mídia e adventícia com simultânea destruição da lâmina elástica que normalmente separa estas compartimentos2. A evidência atual demonstra que o GCA envolve um antígeno desconhecido que ativa as células dendríticas no adventitia vascular, seguido pelo recrutamento de auxiliar células T (Th), especificamente Th1 e Th17 subtipos que secretam Interleucina-17 e interferon-gama (IFG) respectivamente. IFG então recrutas e ativa macrófagos a produzir citocinas e proteases. Estes incluem citocinas pró-inflamatórias; incluindo a IL-12, que reciprocamente, ativa as células Th1, proporcionando assim uma retroalimentação positiva; fator de necrose tumoral e interleucina-6, que causam artrite e febres e metaloproteases que danificam a lâmina elástica. Glicocorticoides (GC), que constituem a padrão terapêutica crónica, parcialmente controlam as vias de citocina, atenuando o Th17/IL-17, mas não o braço de Th1/IFG da resposta imune3,4. Infelizmente, a descontinuação do GC resulta em recaída da doença. Como uma modalidade alternativa, metotrexato tem foi realocado para o tratamento de GCA, mas os pontos de extremidade clínicos desejados não foram consistentemente alcançados, embora mais sensíveis biomarcadores não tenham sido utilizados para terapêutica monitoramento5,6 . Em 2017, o bloqueador de interleucina 6, tocilizumab, foi aprovado para o tratamento de GCA como demonstrou efetivamente o controle de doença e esteroide poupadores efeitos7,8.
Até à data, não há nenhuma boas biomarcadores para GCA. Como resultado, é difícil monitorar a atividade da doença e titula-se doses de drogas disponíveis para evitar efeitos adversos e reduzir a carga de custos para a sociedade. Assim, é imperativo para procurar um biomarcador de candidato que correlaciona-se com atividade de doença, fornecem introspecções novela na patogênese e ajuda nas decisões terapêuticas.
A desregulação da ativação de macrófagos é um fator crítico na patogênese do GCA. Assim, um meio eficaz de tratar a GCA pode ser a seleção de alvos de macrófagos ativados. O beta de receptor de folato (FRB) é uma glicoproteína glycosyl-fosfatidilinositol que está ancorada na membrana celular expressos nas células mielomonocítica normal, as células de leucemia mieloide e ativados macrófagos. Seu ligante, ácido fólico, é uma vitamina essencial na sua forma reduzida, o que permite que celulares DNA síntese, metilação e reparação9. Expressão de FRB é induzida em doença auto-imune e durante a carcinogênese. Sua expressão é restrito à superfície de monócitos ou pró-inflamatórias macrófagos M1 na artrite reumatoide, ou aos anti-inflamatórios M2 de macrófagos em órgãos sólidos e neoplasias mieloides10,11,12 , 13. além de seu papel potencial como um biomarcador de macrófagos ativados, a FRB pode habilitar o transporte seletivo de drogas através de um processo de várias etapa que começa com a ligação ao receptor de ácido fólico, antifolates ou drogas conjugada com ácido fólico na célula superfície, seguido de interiorização, lançamento e eventual entrega de droga desejada para a célula interna máquinas12,14,15,16. Em contraste com a FRB expressa em células cancerosas e ativados macrófagos, FRB, expressa em células hematopoiéticas normais é incapaz de vincular folatos, assegurando que entrega de droga FRB/ácido fólico-mediada é limitada a FRB-positivo inflamatória ou células cancerosas.
Em nosso estudo anterior, temos demonstrado pela primeira vez FRB é expressa em macrófagos GCA e sua expressão correlacionados com CD68 + e endotelina macrófagos de beta do receptor, que contribuem para a patogênese de GCA17. Neste relatório, descrevemos o histopatológico e imuno-histoquímica métodos utilizados para avaliar o macrófago FRB e analisaram os linfócitos totais e macrófago conta ganhar a introspecção em posição a FRB na paisagem vascular GCA.
Protocol
Representative Results
Discussion
GCA é a vasculite mais comum em adultos, e sua marca patológica exemplifica uma potente combinação de linfócitos T helper e ativados macrófagos que também podem ser encontrados em outras doenças granulomatosas ou vasculopathies como sarcoidose e granulomatosa poliangiite2,3. Em GCA, a artéria temporal fornece uma boa representação de tamanho médio a grande artéria e a biópsia TA dá uma amostra considerável que pode ser armazenada em blocos de para…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi feito possível pelo suporte de Stairs de Douglas do Dr., Marianne Klinger, Ann Benko, divisão de Reumatologia/departamento de medicina e o Molecular e histopatológico de núcleo de laboratório, Estado Penn University College of Medicine, Hershey PA.
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
References
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