巨细胞动脉炎叶酸受体贝塔巨噬细胞和血管免疫微环境的免疫组织病理学分析
Summary
该协议说明了使用组织病理学检查和免疫组织化学来描述叶酸受体β巨噬细胞及其与全免疫细胞浸润的关系, 在颞动脉活检在巨细胞动脉炎。
Abstract
巨细胞动脉炎 (gca) 是一种影响老年人的中大型动脉慢性免疫介导的疾病。gca 表现为关节炎和头痛、中风或视力下降的闭塞症状。巨噬细胞和 t 辅助淋巴细胞浸润血管壁, 产生促炎症反应, 导致血管损伤和缺血。到目前为止, 还没有 gca 生物标志物可以监测疾病活动和指导治疗反应。
叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂甾醇蛋白, 锚定在细胞膜上, 通常表达在骨髓细胞系和大多数骨髓性白血病细胞, 以及在肿瘤和类风湿滑膜巨噬细胞,它的表达与疾病的严重程度有关。frb 结合叶酸化合物、叶酸结合剂和抗叶酸药物的能力使其成为癌症和炎症性疾病研究中的一个可吸毒靶点。本报告描述了组织病理学和免疫组化方法, 用于评估 frb 的表达和分布与 gca麻醉正理学。
用血红素和 eosin 对 gca 和正常对照组的福尔马林固定和石蜡包埋的颞动脉活检进行染色, 以回顾组织组织学特征并确定其病理学特征。免疫组织化学用于检测 frb、cd68 和 cd3 的表达。进行了微观分析, 以量化10个选定的高功率场部分的阳性染色细胞的数量及其各自在动脉壁的位置。
淋巴缺血细胞 (lh) 炎症伴内膜增生和弹性片受干扰在 gca 中被发现, 对照组没有发现。lh 浸润由大约60% 的淋巴细胞和40% 的巨噬细胞组成。frb 表达仅限于巨噬细胞, 占 cd688+ 巨噬细胞总数的 31%, 并局部到媒体和外膜。在控件中没有看到 frb。
该方案证明了 frb 巨噬细胞相对于 gca 血管免疫微环境的独特的数值和空间模式。
Introduction
巨细胞动脉炎 (gca) 是一种针对主动脉及其分支并影响老年人的中大动脉炎症性疾病。它表现为轻度至重度缺血性并发症, 如头痛、下巴疼痛、视力下降、中风和组织坏疽。诊断是由高炎症标志物, 如红细胞沉降率 (esr) 和一个独特的组织病理学模式的颞动脉活检 (tab)1证实。gca 是最常见的成人血管炎, 获得诊断的颞动脉的可及性比其他血管病变具有优势, 从而使人们能够更容易地研究其发病机制。tab 上的典型发现包括巨噬细胞 (巨噬细胞) 和 t 淋巴细胞浸润, 这些血管层在内膜、培养基和肌细胞的所有维度层中都有浸润, 同时破坏了通常将这些血管层分开的弹性层隔间2。目前的证据表明, gca 涉及一种未知的抗原, 它激活血管外膜中的树突状细胞, 然后招募辅助 t (th) 细胞, 特别是分泌白细胞介素-17 和干扰素伽玛 (ifg)。ifg 然后招募和激活巨噬细胞产生细胞因子和蛋白酶。这些包括促炎细胞因子;包括 il-12, 它相互激活 th1 细胞, 从而提供一个正反馈回路;肿瘤坏死因子和白细胞介素-6, 引起关节炎和发烧和金属蛋白酶, 损害弹性层。糖皮质激素 (gc) 构成标准的慢性治疗, 通过衰减 th17 il-17 而不是免疫反应的 thiifg 臂 3, 4,部分控制细胞因子通路.不幸的是, 停止 gc 导致疾病复发。作为一种替代方法, 甲氨蝶呤已被重新用于 gca 治疗, 但尽管更敏感的生物标志物尚未用于治疗监测5,6, 但所需的临床终点并没有一致实现。.2017年, 白细胞介素6阻滞剂 tocilizumab 被批准用于治疗 gca, 因为它有效地显示了疾病控制和类固醇的保护效果7,8。
到目前为止, gca 还没有很好的生物标志物。因此, 很难监测疾病活动和对现有药物的滴定剂量, 以避免不利影响, 减轻社会成本负担。因此, 必须寻找与疾病活动相关的候选生物标志物, 提供新的关于发病机制的见解, 并在治疗决策中提供帮助。
巨噬细胞活化失调是 gca 发病机制的关键因素。因此, 治疗 gca 的有效方法可能是选择性靶向活化巨噬细胞。叶酸受体β (frb) 是一种糖基磷脂酰肌醇糖蛋白, 锚定在正常粒细胞细胞、髓样白血病细胞和活化巨噬细胞中表达的细胞膜上。它的配体, 叶酸, 是一种必需的维生素, 在其减少的形式, 这使得细胞 dna 合成, 甲基化和修复9。frb 在自身免疫性疾病和癌变过程中被诱导表达。其表达仅限于类风湿关节炎单核细胞或促炎性 m1 巨噬细胞的表面, 或在固体器官和骨髓恶性肿瘤中的抗炎 m2 巨噬细胞 10, 11,12,13. 除了其作为活化巨噬细胞的生物标志物的潜在作用外, frb 还可以通过一个多步骤的过程, 从细胞内的受体与叶酸、抗叶酸或叶酸结合药物开始, 从而实现选择性药物运输表面, 然后将所需药物内化、释放并最终输送到内部细胞机械 12、14、15、16.与 frb 在癌细胞和活化巨噬细胞中表达相比, 在正常造血细胞中表达的 frb 无法结合叶酸, 从而确保 frb/folt 介导的药物传递仅限于 frb 阳性炎症或癌细胞。
在我们之前的研究中, 我们首次证明了 frb 在 gca 巨噬细胞中的表达, 其表达与 cd688+ 和内皮素受体β巨噬细胞相关, 这对 gca 的发病机制17有一定的贡献。在本报告中, 我们描述了用于评估 frb 巨噬细胞的组织病理学和免疫组织化学方法, 并分析了总淋巴细胞和巨噬细胞计数, 以深入了解 frb 在 gca 血管景观中的位置。
Protocol
Representative Results
Discussion
gca 是成人中最常见的血管炎, 其病理特征体现了 t 辅助淋巴细胞和活化巨噬细胞的有力组合, 也可以在其他肉芽肿性疾病或血管病, 如结节病和肉芽肿性多血管炎2,3。在 gca 中, 颞动脉提供了一个中到大大动脉的良好表示, ta 活检提供了一个相当大的样本, 可以存储在石蜡块多年, 从而创造了机会, 研究新兴诊断和像 frb 这样的治疗靶点在血管微环境中。我?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是在道格拉斯·斯泰尔博士、玛丽安·克林格、安·本科、风湿病系/医学司以及宾州立大学医学院分子和组织病理学核心实验室的支持下得以完成的。
Materials
| Microtome | Reichert-Jung | ||
| plain and frosted microscope slides and cover slips | Fisher Scientific | ||
| Vertical rack | Fisher Scientific | ||
| Light microscope | Olympus BX60 microscope | ||
| Xylene | |||
| Acetone in distilled water | concentrations 100%, 90%, 70% | ||
| Tris-buffered saline solution (TBS) | Dako Wash BufferS3006 | ||
| 3% hydrogen peroxide in TBS | |||
| Diaminobenzidine (DAB) | Sigma Fast Tablet set | ||
| Chemical Permount Mounting Medium | Fisher Scientific | SP-15-100 | |
| Harleco Gill's III Hematoxylin | Fiisher Scientific 23-750-019 | ||
| Harleco Eosin Y 1% Alcoholic Stock Solution | Fisher Scientific | 23-749-977 | |
| 10 mM citric acid monohydrate (pH 6.0) | |||
| Polyclonal rabbit anti-folate receptor beta | Manohar Ratnam | optimized at 1:800 | |
| Monoclonal mouse anti-human CD68 | Dako | M071801 | optimized at 1:200 |
| Polyclonal rabbit anti-CD3 | Agilent Dako | A0452 | optimized at 1:100 |
| Polymer goat anti- rabbit/mouse secondary antibody | Dako | ||
| Placental tissue | for FRB positive control |
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