Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come un potente strumento per lo studio dei cambiamenti che si verificano a livello genomico di organismi biologici. Preparazione del campione per i metodi di NGS può essere variata a seconda del microrganismo, tipo di tessuto, e soprattutto le domande i ricercatori sono desiderosi di indirizzo. Molti studi sono rivolti a NGS come mezzo per studiare le differenze nell’espressione genica tra gli Stati come individui sani e malati^1,2,3,4. Il sequenziamento di prendere posto su una base di intero genoma e consente un ricercatore di catturare la maggior parte, se non tutte, le informazioni genomiche per un marcatore genetico particolare in un momento indicano.

I marcatori più comuni dell’espressione osservati sono il RNA messaggero (mRNA). Le procedure più usate per le librerie durante la preparazione per RNA-seq sono ottimizzate per il recupero di molecole di mRNA mediante l’utilizzo di una serie di purificazioni, frammentazioni e legature^5,6. Tuttavia, la decisione su come un protocollo dev’essere eseguito si basa pesantemente sul tipo di campione e le domande circa il campione ha detto. Nella maggior parte dei casi viene estratto il RNA totale; Eppure, non tutte le molecole di RNA sono di interesse e in casi come gli studi di espressione di mRNA eccessivamente abbondanti specie di RNA, come RNA ribosomiale (rRNA) devono essere rimossi per aumentare il numero di trascrizioni rilevabili connesso con i mRNA. Il metodo più popolare e ampiamente utilizzato per rimuovere le molecole di rRNA abbondante è la riduzione delle trascrizioni di poliadenilazione RNA denominato polyA svuotamento⁷. Questo approccio funziona bene per l’analisi dell’espressione di mRNA come non influenza i trascritti di mRNA. Tuttavia, negli studi che sono interessati a RNA non codificante o virale, deplezione di polyA rimuove anche queste molecole.

Molti studi scelgono di concentrarsi sulla preparazione libreria sequenza di RNA per esaminare sia espressione di mRNA (codifica) o una particolare classe di grande o piccolo RNA non codificanti. Anche se ci sono altre procedure⁸ come la nostra che consentono la preparazione di campioni doppi, molti studi preparano librerie da campioni separati per studi separati quando disponibile. Per uno studio come il nostro, ciò richiederebbe normalmente più campioni di sangue, aumentando il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. L’obiettivo del nostro studio è stato quello di essere in grado di utilizzare sangue intero da animali per identificare e quantificare le diverse classi di entrambi mRNA e RNA non codificanti espressi tra sano e patogenicità suina virus riproduttivo e respiratorio sindrome (HP-PRRSV) ha sfidato suini^9,10 pur avendo solo un campione di sangue intero singolo (2,5 mL) da ogni suino. Per fare questo, abbiamo bisogno di ottimizzare l’estrazione tipica e protocolli di creazione di librerie per generare i dati appropriati per consentire analisi di mRNA e di non-codificanti RNA (ncRNA) espressione¹¹ da un singolo campione.

Ciò ha richiamato la necessità di un protocollo che ha permesso per mRNA e analisi di RNA non codificante perché il kit standard disponibili e metodi per la creazione di estrazione del RNA e la biblioteca sono stati destinati principalmente al mRNA e utilizzano una deplezione di poly-A passaggio¹². Questo passaggio avrebbe reso impossibile il recupero di RNA non codificante o trascrizioni virali dal campione. Di conseguenza, era necessario un metodo ottimizzato che ha permesso per estrazione di RNA totale senza svuotamento polyA campione. Il metodo presentato in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l’uso di sangue intero come tipo di campione e di costruire librerie di sequenziamento per sia mRNA che ncRNAs di piccole e grandi dimensioni. Il metodo è stato ottimizzato per consentire l’analisi di RNA non codificanti rilevabili tutti così come mantenere il RNA virale per successive indagini¹³. In tutto, il nostro protocollo di preparazione libreria ottimizzata consente per l’indagine di più molecole di RNA da un campione di sangue intero singolo.

L’obiettivo generale dietro l’uso di questo metodo era quello di sviluppare un processo che ha permesso per la raccolta di non-codificanti RNA sia mRNA da un campione di sangue intero. Questo ci permette di avere mRNA, ncRNA e RNA virale per ogni animale nel nostro studio provengono da un singolo campione⁹. Questo, in definitiva, consente più scientifico scoperta senza costi aggiuntivi di animale e dà un quadro più completo dell’espressione di ogni singolo campione. Il metodo descritto consente per l’esame dei regolatori dell’espressione genica, nonché a consentire per il completamento degli studi correlativi confrontando entrambi mRNA e l’espressione di RNA non codificanti utilizzando un campione di sangue intero singolo. Il nostro studio ha utilizzato questo protocollo per esaminare i cambiamenti nell’espressione genica e possibili regolatori epigenetici in viralmente infettato 9 – settimana-vecchi maschi maiali commerciali.