RNA tabanlı insan birincil fibroblastlar indüklenmiş Pluripotent kök hücre yeniden programlama

RNase free şartlar altında çalışmayı ve aseptik teknikler mümkün olduğunda kullanın. Tüm hücre kültürü ile ilgili uygulamaları biyolojik Emanet aseptik teknikler kullanarak dolap gerçekleştirin. İnsan hücreleri ile çalışmaları için kurumsal Biyogüvenlik standartlara uygun. 1. reaktifler ve inisiyasyon yeniden programlama hazırlama aygıtları Modifiye-mRNA kodlama programlama faktörler kokteyl hazırlamak. Vitro transkripsiyon, kapatma, gerçekleştirmek ve yordamlar bireysel programlama faktör kodlama değiştirilmiş her mRNA dephosphorylation için daha önce yayımlanmış Protokolü10 izleyin. Son arıtma adım sonra değiştirilmiş mRNA nükleaz ücretsiz su ile elute, saflaştırılmış değiştirilmiş mRNA çözüm 1 U/µL RNase inhibitörü ile ek, bir spektrofotometre kullanarak değiştirilmiş mRNA’ların quantitate ve 6 aya kadar-80 ° C’de depolayın. Donma-çözülme devir sayısını en aza indirmek için değiştirilmiş her mRNA birden çok aliquots hazırlayın.Not: Benzer protokoller değiştirilmiş mRNA üretim-si olmak be için başka bir yerde5,8,11bildirdi. Vitro transkripsiyon için şablonlar PCR güçlendirme Malzemeleri tablo önceden yayınlanmış Protokolü10göre listelenen primerler kullanılarak ilgili plazmid şablonları oluşturulabilir. Plazmid şablonları programlama her faktör için (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, MİCRORNAS, LIN28A) ve mWasabi (denetim transfection için) Addgene, bir kar amacı gütmeyen plazmid deposu mevcuttur. Mix birlikte 3:1:1:1:1:1 molar oranını, değiştirilmiş mRNA (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: MİCRORNAS: LIN28A) ve % 10 içerir mWasabi transfection verimlilik için kontrol olarak mRNA değiştirilmiş. 100 ng/µL son bir konsantrasyon karışıma 1 U/µL RNase inhibitörü ile desteklenmiş nükleaz ücretsiz su ekleyerek yeniden programlama tam değiştirilmiş mRNA konsantrasyonu ayarlayın. Yedi hazırlayın 33 µL aliquots, tam değiştirilme tarihi mRNA kokteyl. Karışık programlama aliquots-80 ° C’de depolayınNot: her transfection için 1000 ng değiştirilmiş mRNA kokteyl iyi eklenir (Yani, toplam 3000 ng 3 kuyuları için). Her 33 µL aliquot 6-şey biçimi plaka 3 kuyu transfect şekilde boyutlandırılır ve pipetting hatalar için hesabınıza fazla birimin 3 µL içerir. Yedi hazırlanıyor 33 µL aliquots bir tam fibroblast 3 Wells bir 6-şey biçimi plaka yeniden programlama tamamlamak için yeterli. MiRNA taklit eder yeniden programlama kokteyl hazırlamak. Liyofilize erime miRNA taklit eder (Syn-vardır-miR-302a – 3p, Syn-vardır-miR-302b – 3p, Syn-vardır-miR – 302c – 3p, Syn-sahip-miR-302d-3 p, Syn-sahip-miR-367-3 p) 5 pmol/µL (5 mikron) son konsantrasyonu nükleaz ücretsiz su 1 U/µL ile RNase inhibitörü ile desteklenmiştir. Her miRNA taklit birden çok aliquots hazırlamak ve uzun süreli depolama için-80 ° C’de depolayın. Tüm miRNA taklit eder bir 1:1:1:1:1 molar oranı 5 pmol/µL (5 mikron) son bir konsantrasyon içinde karıştırın. Yedi hazırlamak miRNA 14 µL aliquots taklit eden karışımı. Karışık aliquots-80 ° C’de depolayınNot: her transfection için iyi (Yani, toplam 3 kuyuları için 60 pmol) başına 20 pmol miRNA taklit eder karışımı eklenir. Her 14 µL aliquot 6-şey biçimi plaka 3 kuyu transfect şekilde boyutlandırılır ve pipetting hatalar için hesabınıza fazla birimin 2 µL içerir. Yedi hazırlanması 14 µL aliquots bir tam fibroblast 3 Wells bir 6-şey biçimi plaka yeniden programlama tamamlamak için yeterli. Transfection arabellek hazırlayın. Önceden sıcak bir 500 mL şişe ve taze azaltılmış-serum orta ve oda sıcaklığında (RT) yaklaşık 2 saat için bir 100 mL şişe. Bir su banyosu kullanmayın. PH metre bir Biyogüvenlik kabini aktarın. Taksimetre cam elektrot nükleaz ücretsiz su ile yıkayın. Üretim talimatlara göre pH metre kalibre. Elektrot tekrar nükleaz ücretsiz su ile yıkayın. Her iki şişe azaltılmış-serum orta Biyogüvenlik kabini aktarın. 500 mL RT şişe pH ayarlamak için kullanın. Azaltılmış-serum orta taban pH pH metre’nın cam elektrot tampon ekleyerek ölçmek. 1 dakikaya kadar pH metre üzerinde okumadan önce bekleyin. 3-4 mL 1 M NaOH azaltılmış-serum orta 500 mL ekleyin, şişe kapatın ve iyice karıştırın. 5 dakikaya kadar pH ölçümü için şişe açmadan önce bekleyin. PH metre’nın elektrot arabellek içine yerleştirin ve pH metre üzerinde okuma stabilize kadar bekleyin. Azaltılmış-serum orta pH 8,15 – 8,17 ulaşıncaya kadar küçük miktarlar 1 M NaOH ekleyerek devam edin. PH metre işlemi sırasında birkaç kez kalibre edin. Herhangi bir noktada pH 8,18 yüksek olursa, önceden ısıtılmış 100 mL şişe (adım 1.3.1) taze azaltılmış-serum orta ekleyerek azaltmak.Not: Azaltılmış-serum transfection orta tabanlı arabellek pH önemlidir. Transfection arabellek pH yaklaşık 8.2 ± 0,05, ancak pH 8,25 yüksek ise başarısız olabilir yeniden programlama başarılı olacaktır. Bu nedenle, bu tampon pH 8,15 – 8,17 ulaştıktan sonra NaOH ekleyerek durdurmak için tavsiye edilir. Bu transfection arabellek son pH Sterilizasyon sonra yaklaşık 8.2-8,22 olduğunu garanti eder. Filtre sterilize 0,22 µm vakum filtrasyon sistemi kullanarak transfection arabellek. Aliquot steril arabellek en az hava alanı olan 5 veya 15 mL tüpler içine. Mağaza aliquots 4 ° C’de 3 aya kadar için transfection önbellek Aliquots pH düzenli aralıklarla ölçün. PH 8,25 yüksek ise aliquots atın. Yalnızca atmosferik havaya maruz transfection arabellek arabellek pH artar bu yana 2 transfections için aliquot kullanımını sınırlamak. Fibroblast genişleme Orta (FEM) hazırlamak: % 10 fetal Sığır serum (FBS), 1 x esansiyel olmayan amino asitler, 1 x glutamin takviyesi, 55 µM 2-mercaptoethanol, 1 x kalem/strep/fungizone ile takıma en az gerekli orta. FEM 4 ° C’de depolayın Programlama ortamı hazırlamak: DMEM/F12 (HEPES) takıma % 20 nakavt serumu değiştirme (KOSR), non-gerekli amino asitler x 0.5, 0.5 x glutamin takviyesi, 55 µM 2-mercaptoethanol, 50 µg/mL askorbik asit, 1 x kalem/strep/fungizone, 100 ng/mL bFGF ile ve 200 ng/mL B18R. BFGF ve B18R yeniden programlama başlanmasından orta hazırlamak ve 4 ° C’de saklayın 1 aydan sonra hazırlık takip kullanmayın. BFGF ve B18R her kullanımdan hemen önce o günkü kullanım için boyutlu bir aliquot ekleyin. Kaplama orta ısı inaktive %5 (HI) FBS % 20 içeren programlama orta içine ekleyerek hazırlamak KOSR bFGF ve B18R adım 1.5 olmadan. Orta boy taze kullanım amacı gününde hazırlamak. BFGF ve B18R hemen gün 0 yeniden programlama üzerinde kullanmadan önce ekleyin. Doku kültürü İnkübatörler bir el dijital CO2 Çözümleyicisi’ni kullanarak üreticinin yönergelerine göre yeniden programlama işlemini başlatmadan önce kalibre. Düşük-O2 kuluçka programlama adımlar için başarılı IPSC üretimi sağlamak için kullanın. 2. kültür fibroblastlar yeniden programlama için Fibroblastlar (gün -2) yeniden programlama başlanmasından önce hazırlayın. Yeni 10 cm doku kültürü plakalı 5 mL %0,1 jelatin de kat. Dokunun veya tüm yüzeyi kaplanır emin olmak için plaka girdap. 37 ° C’de 15 dakika kuluçkaya Jelatin Aspire edin ve 10 mL FEM. kümesinin bir kenara ekleyin. FEM. eklemeden önce kurumasını plaka kaplı yüzey izin verme Dikkatle fibroblastlar harcanan ortamından Aspire edin. 5 mL DPBS arta kalan serum kaldırmak için de bir kez hücrelerle durulayın. Tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Yavaşça hücrenin üzerine tam kapsama sağlamak için plaka rock. Tripsin ~ 500 µL bırakarak aşırı sıvı Aspire edin. Değil aşırı Aspire edin, çünkü bu kuru ve fibroblastlar öldürmek. Tripsin-EDTA 37 ° C’de 3 dk ile fibroblastlar kuluçkaya Plaka da kuluçka kaldır ve nazikçe ama sıkıca hücreleri çıkarmak için plaka yan dokunun. Mikroskop altında hücreleri denetleyin. Müstakil ve yüzen hücreleri, devam edin. Hücreleri hala iliştirilmişse, başka bir 3 dakikadır kuluçkaya. Hızlı durulama/5 mL FEM de tripsin-EDTA nötralize etmek için kullanarak müstakil hücreleri toplamak. Fibroblast süspansiyon 15 mL konik tüp içine taşıyın. Hücreleri iyi karışık olduğundan emin olun. Hücre süspansiyon hücre büyük kümeleri kırmak, sonra bir hemasitometre Sayın karışımı yavaşça. 2.1.1. adımda hazırlanan jelatin kaplı 10 cm çanak içine transfer 2.5 x 105 hücreleri. 37 ° C, % 5 CO2 oksijen normal doku kültürü kuluçka gecede hücrelerde kuluçkaya.Not: Bu fibroblastlar sağlıklı ve hızlı bir şekilde ayıran önemli olduğu hücre yoğunluğu yüksek programlama verim elde etmek için önemlidir. 2.5 x 10 kaplama5 hücreleri çoğu fibroblast örnekleri 2 gün sonra % 40-60 confluency verir. Miktar buna göre ayarlamak istediğiniz % 40-60 confluency 48 saat sonra ulaşmak hastalıklı veya senescent hücreler için. Orta 10 mL taze FEM ile ertesi gün (gün -1) değiştirin. (Gün 0) yeniden programlama başlatmak için fibroblastlar plaka. Yeniden programlanan fibroblastlar % 40-60 confluency (Şekil 2, gün 0) olduğundan emin olun. Hücreleri üzerinde veya altında birleşmesi ise, fibroblastlar 2.1 adımda anlatıldığı gibi geçiş ve kaplama yoğunluğu buna göre ayarlayın. Kültür başka bir iki gün için. DPBS 4 mL 15 mL konik tüp içine aktarın. Rekombinant insan (rh) laminin-521 100 µL ekleyin. Yukarı ve aşağı pipet iyice karıştırmak için. 1 ml sulandırılmış rhLaminin-521 kuyu başına 6-şey plaka 3 kuyu ekleyin. 2 h 37 ° C’de kaplamalı plaka kuluçkaya. 6 mL FEM ve orta 37 ° C’ye kaplama 4 mL sıcak Kaplama orta 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için bFGF ve B18R 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ek. Dikkatle fibroblastlar (adım 2.2.1) harcanan ortamından Aspire edin. DPBS 5 mL hücrelerle durulama ve tripsin-EDTA 3 mL ekleyin. Yavaşça tripsin-EDTA hücrelerle kapsayacak şekilde plaka rock. Tripsin, ~ 500 µL adım 2.1.3 yapılır gibi bırakmak aşırı sıvı Aspire edin. Tripsin-EDTA 37 ° C’de 3 dk ile fibroblastlar kuluçkaya Plaka da kuluçka kaldırmak ve nazikçe ama sıkıca hücreleri çıkarmak için plaka yan dokunun. Mikroskop altında hücreleri denetleyin. Müstakil ve yüzen hücreleri, devam edin. Hücreleri hala iliştirilmişse, başka bir 3 dakikadır kuluçkaya. Durulama/5 mL FEM de tripsin-EDTA nötralize etmek için kullanarak müstakil hücreleri toplamak. Fibroblast süspansiyon 15 mL konik tüp içine taşıyın. Hücreleri iyi karışık ve bir hemasitometre Sayın emin olun. Pipet 12.000 hücrelere prewarmed kaplama orta adım 2.2.4 4 mL.Not: herhangi bir noktada hücreleri santrifüj kapasitesi değil. Kaplama hücre sayısı ayarlanabilir yukarı ya da aşağı yavaş – veya hızlı büyüyen satırları için gerekli olarak anılan sıraya göre. Kaplamalı plaka kuluçka makinesi kaldırmak ve sulandırılmış rhLaminin-521 kaplamalı kuyulardan Aspire edin. Kuyu kuru yüzeyine izin vermez. Yavaşça kaplama orta hücrelerde resuspend. Hücre süspansiyon 1 mL pipet kaplı her içine iyi (Yani, 3000 iyi başına hücre). Kaplama hücreleri (düşük-O2) % 5 ayarla O2 tri-gaz doku kültürü kuluçka makinesi yerleştirin. Plaka ayarlandıktan sonra yavaşça ama iyice hücreleri yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket arasında değişen tarafından dağıtmak. Hareketleri 2 kez daha tekrarlayın. Hücreleri gecede kuluçkaya. Karıştırmak için plaka girdap değil. 15 mL konik tüp ortamına yeniden programlama 4 mL pipet ve düşük-O2 kuluçka gecede equilibrate gevşetti bir kap ile yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin. 3. inisiyasyon Reprogramming (1 gün) Not: bir kez yeniden programlama başlatılır, günlük bakım yaklaşık 1 ay için gereklidir. Buna göre plan emin olun. Tüm sonraki hücre incubations 37 ° C, % 5 CO2, %5 O2 oksijen tri-yakıt doku kültürü Ekstraktörü düşük-O2 koşullarda gerçekleştirilmesi gerekir. En az 1 transfection önce s kaplama orta yerine. Dengelenmiş programlama orta düşük-O2 kuluçka makinesi kaldırın. BFGF 100 ng/mL ve B18R son bir konsantrasyon 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. İyice karıştırın. 1 ile de teker teker devam etmeden önce 1 mL pipet harcanan orta kaldırmak ve programlama orta bFGF ve B18R ile 1 mL ile değiştirmek için kullanın. Her şey için bu işlemi yineleyin. Aşırı hücreleri kurur, stres nedenleri ve programlama verimliliği azaltır vakum aspirasyon, kullanmayın. Hücreleri ile plaka geri düşük-O2 kuluçka makinesi taşıyın. Fibroblastlar RNAiMax transfection reaktif değiştirilmiş mRNA 1 µg başına 5 µL ile transfect ve transfection transfection reaktif miRNA 6 pmol başına 1 µL taklit eder.Not: transfections 16-20 h için ilerlediğinizde en iyi sonuçlar elde edilir. Transfection reaktif seyreltilmiş 10 olduğunu x; 100 ng/µL değiştirilmiş mRNA kokteyl mi 5 x seyreltilmiş; ve çok güzel 5 pmol/µL miRNA taklit eder 8,33 x complexation önce transfection arabellek ile seyreltilmiş. Transfection kurulum Özeti için bkz. Tablo 1 . Transfection hazırlama karışımları iken, potansiyel reaktifler maruz RNase standart laboratuar uygulaması takip ederek en aza indirmek. Bir aliquot RT. yaklaşık 1 h için transfection önbellek (adım 1.3) equilibrate 37 ° C su banyosu veya kuluçka transfection arabelleğini ısıtmak için kullanmayın. Değiştirilmiş (33 µL) mRNA’ların tek bir aliquot çıkarmak ve miRNA-80 ° C’den (14 µL) taklit eder ve onları RT için yaklaşık 3-5 dk için çözdürülen kadar sıcak. Aliquots 37 ° C’de erimek değil Onları kısa bir süre içinde bir microfuge spin aşağı. RT transfection reaktif için yaklaşık 3-5 dk sıcak. 37 ° C su banyosu veya kuluçka makinesi kullanmayın. 2-3 kez kapalı tüp ters reaktif karıştırmak için. Aşağı kısa bir süre içinde bir microfuge sıralayacağız. RT transfection arabelleği 279 µL RNase free microcentrifuge tüp içine aktarın. 310 µL. bir son hacmi elde etmek için transfection reaktif 31 µL eklemek pipetting tarafından iyice karıştırın. Değil girdap yapmak. RT at tüp 1 dk. için kuluçkaya.Not: Bu seyreltilmiş transfection reaktif hacmi için karmaşık yeterli değiştirilmiş mRNA ve miRNA aliquots adım 3.2.3 taklit eder. RT transfection arabelleği 132 µL değiştirilmiş mRNA 33 µL aliquot ekleyin. Yavaşça karıştırmak için pipet: son 165 µL birimdir. RT transfection arabelleği 102.6 µL miRNA taklit eder 14 µL aliquot ekleyin. Yavaşça karıştırmak için pipet: son 116.6 µL birimdir. Adım 3.2.5 seyreltilmiş transfection reaktif seyreltilmiş için 165 µL mRNA 3.2.6 adımından değiştirilme tarihi ekleyin. Pipet karıştırmak için: 330 µL son birimdir. Seyreltilmiş transfection reaktif 116.6 µL 3.2.5 adımından 3.2.7. adımdaki seyreltilmiş miRNA taklit eder karışıma ekleyin. İyice karıştırın (son hacim ise 233.2 µL). RT transfection arabelleğe değiştirilmiş mRNA’ların ile karmaşık izin vermek için 15 dk için kuluçkaya ve miRNA taklit eder. Hücreleri ile plaka düşük-O2 kuluçka kaldırın. 100 µL (1 µg) complexed, mRNA transfection karıştırmak için her şey dropwise iyi değiştirilme tarihi ekleyin. Yavaşça ama iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı transfection kompleksleri tarafından dağıtmak. Karıştırmak için plaka girdap değil. 66.7 µL (20 pmol), her şey için dropwise arasında iyi complexed miRNA taklit eder transfection karışımı ekleyin. Yavaşça ama iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı transfection kompleksleri tarafından dağıtmak. Karıştırmak için plaka girdap değil. Transfected hücreleri (düşük-O2) % 5 ayarla O2 tri-Yakıt Ekstraktörü yerleştirin. Plaka ayarlandıktan sonra transfection kompleksleri tarafından tekrar yavaşça iyice yukarı/aşağı sonra sola/sağa hareket ile plaka Tantanacı ama dağıtmak. Orta 15 mL konik tüp içine yeniden şekillendirmek için 4 mL pipet ve düşük-O2 kuluçka gevşetti kapaklı bir gecede equilibrate yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin. Tüp 1 – RNAiMax seyreltme (1 mix) Reaktif Konsantrasyon Birim Transfection arabellek 279 ΜL RNAiMax (2 eklemek) 10 x 31 ΜL Toplam: 310 µL (Oda sıcaklığında 1 dk kuluçkaya) Tüp 2 – değiştirilmiş mRNA mix (2 mix) Reaktif Konsantrasyon Birim değiştirilmiş mRNA mix 100 ng/µL (5 x) 33 ΜL Transfection arabellek 132 ΜL Toplam Sonuç: 165 µL (seyreltilmiş RNAiMax eşit hacimli tüp 1 ekleyin) Tüp 3 – miRNA taklit eder mix (3 mix) Reaktif Konsantrasyon Birim miRNA mix taklit eder. 5 pmol/µL (8.33 x) 14 ΜL Transfection arabellek 102.6 ΜL Toplam: 116.6 µL (seyreltilmiş RNAiMax eşit hacimli tüp 1 ekleyin) Tablo 1: Hazırlık transfection karıştırın. 4. Transfections arasında Reprogramming orta yerine (2, 4, 6, 8, 10 ve 12 gün) Orta 16 – 20 h sonrası transfection 3.1.1–3.1.2 içinde açıklandığı gibi değiştirin. BFGF 100 ng/mL ve B18R son bir konsantrasyon için 200 ng/mL nihai bir konsantrasyon programlama orta aliquots içine ekleyin. Transfection kalite EGFP görselleştirmek için yapılandırılmış bir mikroskop kullanarak onaylamak için mWasabi ifade her gün izlemek.Not: mWasabi ifade 2 günde en az belirgin olmalı ve her ek transfection ile parlaklığı artırmak. 5. diğer-günlük Transfections (3, 5, 7, 9, 11 ve 13 gün) Transfection 3.2 adımda anlatıldığı gibi gerçekleştirin. Orta transfection günlerde değiştirmeyin. Orta yeniden programlama, 4 mL aliquot hazırlamak ve ertesi gün orta değiştirmek için equilibrate için düşük-O2 kuluçka yerleştirin. BFGF ve B18R kadar ertesi gün eklemeyin. 6. son Transfection sonra gerçekleştirilecek işlemleri Günlük orta değişimleri 14 günde yaklaşık gerçekleştirmek gün 17. Orta 37 ° c olarak yeniden programlama 7 mL sıcak BFGF 100 ng/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.Not: B18R artık son transfection sonra gerekli değildir. Gün 14, bu artık orta gecede düşük-O2 kuluçka equilibrate gereklidir. Orta serolojik pipet kullanarak bütün kuyulardan kaldırın. Aspirasyon kullanmamak devam edin. Orta bFGF iyi ücret ile takıma yeniden programlama 2 mL ekleyin. 17 ve 18 gün üzerinde bir ters veya diseksiyon mikroskop altında programlanmış wells analiz. Koloniler birbirlerine yakın yeniden programlama, yüksek verimlilik nedeniyle oluşan ve el ile izole olamaz, kolonilerin programlanmış Wells aşağıdaki 7. adımda açıklanan bir isteğe bağlı passaging gerçekleştirerek ayırın. El ile kolonileri seyrek ve iyi ayrılmış ise, doğrudan doğruya–dan programlanmış klonlar adım 8 ve alt kültür iPSCs göre standart protokolleri de açıklandığı gibi seç. 7. isteğe bağlı usulü: Hücreleri Reprogrammed EDTA kullanarak kuyulardan Passaging 0,5 mM EDTA DPBS (EDTA) 0, 5 M EDTA hisse senedi çözüm sulandrarak hazırlayın. Filtre sterilize EDTA 0,22 µm vakum filtrasyon sistemi kullanarak. Besleyici-Alerjik pluripotent kök hücre (PSC) Orta (Örneğin, mTeSR1) üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Önceden sıcak 32 mL PSC orta ile 37 ° c Üreticinin yönergelerini izleyerek bütün wells ile hücre dışı matriks (ECM) hESC tam iki 6-şey biçimi plakaların kat. Parafin film ile plakalarının ve onları RT. 1 h için kuluçkaya Önceden ısıtılmış tabaklar ECM çözümden Aspire edin ve PSC orta iyi başına 2 mL ile değiştirin. Kuyu kuru yüzeyine izin vermez. Onları bir kenara koyun. Ne zaman koloniler büyük ve açıkça kurulan bir günde 2 programlanmış wells programlama ortamından Aspire (genellikle gün 18). Bir kez 1 mL EDTA ve Aspire edin ile yıkayın. EDTA 1 mL de başına ekleyin. 4 dk. 37 ° C’de için kuluçkaya Yavaşça kuluçka makinesi plaka çıkarın ve biyogüvenlik kabine yerleştirin.Not: Bu noktada, çok gevşek yapıştırılır ve kolayca yerinden çıkar hücreler olabilir. Dikkatli bir şekilde her iki kuyulardan EDTA Aspire edin. Her iyi EDTA ile tedavi için önceden ısıtılmış PSC orta 3 mL ekleyin. Yavaşça ama iyice hücreleri her iki kuyulardan çıkarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın. Yavaşça hücre süspansiyon pipette ve büyük kümeleri kadar kırmak için serolojik pipet kullanın. Tüm hücre kümeleri yok olana pipet değil. IPSC kümeleri korumak.Not: büyük kümeleri kaplama IPSC koloni sonucu etkilemez. Son derece büyük hücre kümeleri varsa, sadece onları sonraki amacına aktarılmasını önlemek. Serolojik pipet kullanarak, EDTA tedavi her kuyudan hücreleri tarafından pipetting 0.5 mL ECM kaplı 6-şey plaka her kuyuya dağıtabilmenizi.Not: hücreleri reprogrammed kuyulardan birleştirmek değil (de yeniden programlananYani, 1 eşit olarak dağıtılacak ilk 6-şey plaka ve programlanmış iyi 2 eşit olarak dağıtılacak ikinci 6-şey plaka). Kaplama hücreleri geri düşük-O2 kuluçka makinesi taşıyın. Hücreler eşit olarak dağıtmak için her plaka ileri geri ve yan yana sallayın. Girdap değil. PSC orta her gün değiştirin. 8. malzeme çekme IPSC kolonileri PSC orta ile 37 ° c önceden sıcak 15 mL Tek bir 6-şey plaka tüm kuyu üreticinin yönergeleri izleyerek ECM hESC tam kat. Parafin film ile plakalarının ve onları RT. 1 h için kuluçkaya Kuyu iPSCs toplamak için kullanılan kültür ortamından Aspire edin. Bir kez 1 mL EDTA ve Aspire edin ile yıkayın. EDTA 1 mL de başına ekleyin. 4 dk. 37 ° C’de için kuluçkaya Hücreleri kuluçka, önceden ısıtılmış tabaklar ECM çözümden Aspire edin ve PSC orta iyi başına 2 mL ile değiştirin. Tabakları bir kenara koyun. Yavaşça iPSCs kuluçka makinesi çekilmesi ve Biyogüvenlik kabini yeri ile plaka çıkarın.Not: Bu noktada, çok gevşek yapıştırılır ve kolayca yerinden çıkar hücreler olabilir. Dikkatle EDTA Aspire edin. Çok yavaşça IPSC kolonileri çıkarmak değil için dikkat çekici önceden ısıtılmış PSC orta 3 mL ekleyin. Daha iyi bir ters veya parçalanmış kapsama plakasına görselleştirmek kolonileri taşıyın. 1 mL pipet steril bir ipucu ile hazırlayın. Pistonu tamamen bunalıma girmek sonra pipet ucu hafifçe yavaş yavaş koloni toplamak için belgili tanımlık uç sıvı çizerken bir koloni kazımak için kullanın. Mümkün olduğunca küçük orta olarak IPSC koloni tespit ederken çizin. Koloni aktarmak için yukarı ve aşağı 3-4 kez adım 8.2 ECM kaplı plaka tek bir kuyu içinde pipet. 6 kolonileri seçtim ve tek tek kuyu transfer kadar yineleyin. Bir isteğe bağlı 7. adımda açıklanan passaging gerçekleştirilen fazla 2 kolonileri tek herhangi bir kuyudan almak. Tüm kalan wells dondurmak için bir standart insan kök hücre protokolünü kullanır. Çözülme ve daha fazla koloniler daha sonra çekilmiş olmalı eğer dondurulmuş stokları yeniden plakası. 9. iPSCs karakterizasyonu TRA-1-60 verimliliği (gün 18) yeniden programlama analizi için boyama gerçekleştirmek.Not: 2 dışarı-in yeniden programlanan 3 kuyu gelecekteki koloni çekilmeye pasajlı. Kalan de kullanılabilir TRA-1-60 boyama için. Bu yordam laboratuvar tezgah üstüne gerçekleştirilebilir. Programlanmış PBS de 1 mL ile yıkayın. -20 ° c 5 min için buz gibi metanol ile hücreleri tamir. Metanol Aspire edin. Kuru kuyu yaklaşık 2 dakika süreyle değil aşırı kuru için dikkatli olun. Hücreleri yeterince şeffaf/örtü rengi olduklarında kurumuş. PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. Yıkama sırasında 3 mL %3 hidrojen peroksit PBS içinde hazırlamak. PBS Aspire edin. 2 mL sulandırılmış peroksit çözeltisi ekleyin. Nazik sallayarak ile 15 dakika RT, kuluçkaya. 4 mL engelleme çözeltisi hazırlamak: PBS % 10 Sığır serum albumin (BSA). Peroksit çözüm Aspire edin. PBS 1 mL ile de 2 kez 5 dakika yıkayın. PBS Aspire edin ve çözüm kuyuya engelleme 2 mL ekleyin. Dik, 1 h için kuluçkaya PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. 1: 0 0.05 sodyum azid ile desteklenmiş engelleme çözümde, birincil anti-TRA-1-60 antikor sulandırmak. 1 mL 1 için antikor seyreltme de, bir 6-iyi biçim yemek hazırlamak. Antikor seyreltme kuyuya ekleyin ve buharlaşma önlemek için parafilm ile plaka sarın. Gecede 4 ° C’de nazik sallayarak ile kuluçkaya.Not: gerekirse, birincil antikor ile kuluçka RT nazik sallayarak ile 1 h için yapılabilir. Birincil antikor seyreltme ilâ 5 kere yeniden kullanılabilir. Birincil antikor ile kuluçka sonra PBS 1 mL ile de 3 kez nazik sallayarak ile 5 dakika yıkayın. İkincil Anti-fare HRP Birleşik antikor engelleme çözüm 1: 200, seyreltik. RT nazik sallayarak ile 2 h için ikincil antikor seyreltme ile iyi kuluçkaya. İkincil antikor seyreltme Aspire edin ve nazik sallayarak ile 5 min için PBS 1 mL ile de 3 kere yıkayın. Üçüncü yıkama sırasında üreticinin öğretim takip substrat çözeltisi hazırlamak. Son yıkama sonra PBS Aspire edin. 1 mL substrat çözeltisi ekleyin ve istediğiniz renk (yaklaşık 10 dakika) oluşturuncaya dek kuluçkaya. Substrat çözeltisi Aspire edin. Hafifçe sallayarak süre iyi 5 min için su ile durulayın. Koloniler, isterseniz Sayın. Verimliliği yeniden programlama = (kolonileri sayısı) / (kaplama fibroblast sayısı) x 0. Uzun süreli depolama, su lekeli plaka Aspire edin ve gecede RT. mühür parafilm ile kurutulmuş plaka kurumasına ve programlama verimliliği daha sonra değerlendirmek 2 yıl 4 ° C’de saklarız.