Basado en el ARN la reprogramación de fibroblastos primarios de humanos en células madre pluripotentes inducidas

Trabajar en condiciones libres de RNasa y utilizar técnicas asépticas cuando sea posible. Realizar todas las manipulaciones relacionadas con el cultivo celular en un gabinete usando técnicas asépticas de seguridad biológica. Siga las normas de bioseguridad institucional para el trabajo con células humanas. 1. reactivos y equipos para preparación de reprogramación iniciación Preparar los factores de reprogramación codificación Cóctel de ARNm modificado. Seguir el protocolo previamente publicados10 para realizar en vitro transcripción, tapado y desfosforilación procedimientos para cada ARNm modificado codificación individual factor de reprogramación. Después del paso de la purificación final, procederá a la elución del mRNA modificado con agua libre de nucleasa, complementar la solución purificada de ARNm modificado con 1 inhibidor de la Rnasa U/μl, cuantificar los mRNAs modificados usando un espectrofotómetro y almacenar a-80 ° C hasta por 6 meses. Preparar varias alícuotas de cada mRNA modificada para reducir al mínimo el número de ciclos hielo-deshielo.Nota: Protocolos similares para modificado mRNA producción han sido registrados en otras partes5,8,11. Plantillas para la transcripción en vitro pueden ser generadas por amplificación por PCR de las correspondientes plantillas de plásmido usando las cartillas enumeradas en la Tabla de materiales según el protocolo publicado anteriormente10. Plantillas de plásmido para cada factor de reprogramación (M3O9, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) y mWasabi (control de transfección) están disponibles en Addgene, un repositorio de plásmido sin fines de lucro. Mezclar todos los mRNAs modificados en una proporción molar de 3:1:1:1:1:1 (M3O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) y 10% mWasabi modificado mRNA como control de la eficiencia de transfección. Ajustar la concentración del mRNA modificada completa reprogramación de mezcla a una concentración final de 100 ng/μl añadiendo complementado con 1 inhibidor de la Rnasa U/μl de agua libre de nucleasa. Preparar siete 33 alícuotas de μl de las completas modificación Cóctel de mRNA. Almacenar las alícuotas reprogramación mixtas a-80 ° C.Nota: para cada transfección, 1.000 ng del cóctel de ARNm modificado se agrega por pozo (es decir, un total de 3.000 ng para 3 pozos). Cada 33 μl alícuota está dimensionada para transfectar 3 pocillos de una placa de la pozo 6 formato e incluye 3 μl de volumen de exceso para tener en cuenta errores de pipeteo. Preparar siete 33 alícuotas μl es suficiente para completar una reprogramación de fibroblastos completo de 3 pozos de una placa de la pozo 6 formato. Preparar el cóctel de reprogramación miRNA imitadores. Imitadores de miRNA disolver liofilizado (Syn-ha-miR-302a – 3P, Syn-ha-miR-302b – 3P, Syn-ha-miR – c 302-3p, Syn-ha-miR-302d-3 p, Syn-ha-miR-367-3 p) a una concentración final de 5 pmol/μl (5 μm) en agua libre de nucleasa, complementado con 1 U/μl de inhibidor de la Rnasa. Prepare varias alícuotas de cada imitador de miRNA y almacenar a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo. Mezclar todos los imitadores de miRNA en una proporción molar de 1:1:1:1:1 a una concentración final de 5 pmol/μl (5 μm). Preparar siete 14 alícuotas de μl de la miRNA imita mix. Almacenar las mezcladas alícuotas a-80 ° C.Nota: Para cada transfección, 20 pmol de la mezcla de los imitadores de miRNA se agrega por pozo (es decir, un total de 60 pmol de 3 pozos). Cada 14 μl alícuota está dimensionada para transfectar 3 pocillos de una placa de la pozo 6 formato e incluye 2 μl de volumen de exceso para tener en cuenta errores de pipeteo. Preparar siete 14 alícuotas μl es suficiente para completar una reprogramación de fibroblastos completo de 3 pozos de una placa de la pozo 6 formato. Preparar el buffer de transfección. Caliente previamente una botella de 500 mL y un frasco de 100 mL de medio fresco de suero reducido a temperatura ambiente (RT) por aproximadamente 2 h. No use un baño de agua. Transferencia de un medidor de pH a un gabinete de bioseguridad. Lave el electrodo de vidrio del medidor con agua libre de nucleasa. Calibrar el medidor de pH según las instrucciones del fabricante. Lave el electrodo otra vez con agua libre de nucleasa. Dos botellas de suero reducido medio de transferencia en el gabinete de seguridad de la biotecnología. Use la botella de 500 mL RT para ajustar el pH. Medir el pH base del suero reducido medio insertando el electrodo de vidrio del medidor de pH en el búfer. Esperar 1 min antes de leer el pH en el medidor. Agregar 3 – 4 mL de 1 M NaOH en 500 mL de suero reducido medio, cierre el frasco y mezclar bien. Esperar hasta 5 minutos antes de abrir la botella para medición del pH. Introduzca el electrodo del medidor de pH en el búfer y espere hasta que se estabilice la lectura en el medidor de pH. Seguir añadiendo pequeñas cantidades de 1 M NaOH hasta que el pH del suero reducido medio alcance 8.15 – 8.17. Calibrar el pH-metro varias veces durante el proceso. Si en cualquier momento el pH llega a ser superior a 8.18, reducir mediante la adición de medio fresco de suero reducido del frasco con 100 mL (paso 1.3.1).Nota: El pH del buffer suero reducido basado en el medio de transfección es crítico. Reprogramación tendrá éxito si el pH del buffer de la transfección es aproximadamente 8,2 ± 0.05 pero puede fallar si el pH es superior a 8.25. Por lo tanto, se aconseja dejar de añadir NaOH una vez que pH del tampón alcanza 8.15 – 8.17. Esto asegurará que el pH final del búfer de la transfección es aproximadamente 8.2 – 8.22 después de la esterilización. Filtro de esterilizar el búfer de transfección con un sistema de filtración de vacío 0.22 μm. Alícuota del tampón esterilizado en tubos de 5 o 15 mL con un mínimo espacio de aire. Guardar alícuotas del búfer de la transfección por hasta 3 meses a 4 ° C. Medir el pH de las alícuotas periódicamente. Deseche las alícuotas si el pH es superior a 8.25. Limitar uso de alícuota a 2 transfecciones solamente puesto que la exposición del búfer de la transfección a aire atmosférico aumenta el pH del buffer. Preparar el medio de expansión del fibroblasto (FEM): medio esencial mínimo suplementado con 10% suero fetal bovino (FBS), 1 x aminoácidos no esenciales, suplemento de glutamina x 1, 55 μm 2-Mercaptoetanol, 1 x lápiz/strep/fungizone. Tienda la FEM a 4 ° C. Prepare el soporte de reprogramación: DMEM/F12 (no HEPES) suplementado con 20% nocaut suero reemplazo (KOSR), 0,5 x aminoácidos no esenciales, suplemento de glutamina x 0.5, 55 μm 2-Mercaptoetanol, 50 μg/mL de ácido ascórbico, 1 x lápiz/strep/fungizone, bFGF de 100 ng/mL y 200 ng/mL B18R. Preparar el medio en el inicio de la reprogramación sin bFGF y B18R y almacenar a 4 ° C. No use más allá de 1 mes después de la preparación. Añadir bFGF y B18R inmediatamente antes de cada uso a una parte alícuota de tamaño para el uso de ese día. Prepare el soporte de placas mediante la adición de 5% inactivado con calor (HI) equipos en el medio de reprogramación que contiene 20% KOSR sin B18R de paso 1.5 y el bFGF. Preparar el medio fresco el día de uso. Añadir bFGF y B18R inmediatamente antes de su uso en el día 0 de reprogramación. Calibrar los incubadores de cultivo de tejidos antes de iniciar la reprogramación según las instrucciones del fabricante utilizando un analizador digital mano de CO2 . Uso de una incubadora de baja O2 de los pasos de reprogramación para iPSC exitosa generación. 2. cultivo de fibroblastos para reprogramar Preparar los fibroblastos antes de la iniciación de reprogramación (día -2). Capa una nueva placa de cultivo de tejidos de 10 cm con 5 mL de 0.1% de gelatina. Toque o agitar la placa para asegurarse de que está cubierta toda la superficie. Incubar por 15 min a 37 ° C. Aspire la gelatina y añadir 10 mL de FEM. conjunto a un lado. No permita que la superficie cubierta de la placa se seque antes de agregar el FEM. Aspirar cuidadosamente el medio gastado de los fibroblastos. Enjuague las celdas una vez con 5 mL de DPBS para eliminar el suero residual. Añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Muévalo suavemente la placa para asegurar la cobertura completa sobre las células. Aspire el exceso de líquido, dejando ~ 500 μl de la tripsina. No aspirar demasiado, ya que esto puede secar y matar a los fibroblastos. Incubar los fibroblastos con tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C. Retire la placa de la incubadora y firme pero suavemente golpee el lado de la placa para desalojar a las células. Compruebe las células bajo el microscopio. Si las células son separadas y flotante, proceder. Si las células están todavía Unidas, incubar durante otros 3 minutos. Rápidamente enjuague recopilar las células separadas usando 5 mL de FEM para neutralizar el tripsina-EDTA. Pasar la suspensión de fibroblastos a un tubo cónico de 15 mL. Asegúrese de que las células estén bien mezcladas. Mezclar suavemente la suspensión celular para romper grumos grandes de las células, y luego contarlas en un hemocitómetro. Transferencia de 2.5 x 105 células en el plato 10 cm recubierta de gelatina preparada en el paso 2.1.1. Incube las células durante la noche de la 37 ° C, 5% CO2 cultura de tejido regular humidificado incubadora.Nota: La densidad celular es crítica para lograr alta eficiencia de reprogramación, ya que es importante que los fibroblastos son saludables y dividir rápidamente. Galjanoplastia de 2.5 x 105 células produce una confluencia de 40-60% 2 días más adelante para la mayoría de las muestras del fibroblasto. Ajustar en consecuencia la cantidad de células senescentes o enfermas alcanzar la deseada 40-60% de confluencia 48 h más tarde. Reemplazar el medio con 10 mL de FEM fresco al día siguiente (día -1). La placa de los fibroblastos para iniciar la reprogramación (día 0). Verifique que los fibroblastos a introducirse en la confluencia de 40 a 60% (figura 2, día 0). Si las células son excesivo o debajo-confluentes, paso los fibroblastos como se describe en el paso 2.1 y ajustar en consecuencia la densidad de placas. Cultura por otros 2 días. Transferir 4 mL de DPBS en un tubo cónico de 15 mL. Añada 100 μl del laminin-521 recombinante humano (rh). Pipetee hacia arriba y hacia abajo para mezclar bien. Añada 1 ml por pozo de rhLaminin-521 diluido en 3 pocillos de una placa de 6 pozos. Incube la placa revestida a 37 ° C por 2 h. Calentar 6 mL de FEM y 4 mL de placas medio a 37 ° C. Complementar el medio forro con bFGF a una concentración final de 100 ng/mL y B18R a una concentración final de 200 ng/mL. Aspirar cuidadosamente el medio gastado de fibroblastos (paso 2.2.1). Lavar las células con 5 mL de DPBS y añadir 3 mL de tripsina-EDTA. Muévalo suavemente la placa para cubrir las células con tripsina-EDTA. Aspire el exceso de líquido, dejando ~ 500 μl de tripsina, como en el paso 2.1.3. Incubar los fibroblastos con tripsina-EDTA durante 3 min a 37 ° C. Retire la placa de la incubadora y firme pero suavemente golpee el lado de la placa para desalojar a las células. Compruebe las células bajo el microscopio. Si las células son separadas y flotante, proceder. Si las células están todavía Unidas, incubar durante otros 3 minutos. Enjuague/recoger las células separadas usando 5 mL de FEM para neutralizar el tripsina-EDTA. Pasar la suspensión de fibroblastos a un tubo cónico de 15 mL. Asegúrese de que las células están bien mezcladas y contarlas en un hemocitómetro. Pipetear las 12.000 células en 4 mL de medio de placas precalentadas de paso 2.2.4.Nota: No centrifugar las células en cualquier momento. El número de células plateados se puede ajustar hacia arriba o hacia abajo según se requiera para las líneas o rápida-lenta, respectivamente. Retire la placa de cubierta de la incubadora y Aspire rhLaminin-521 diluido de los pocillos recubiertos. No permita que la superficie de los pozos se sequen. Resuspender suavemente las células en el medio de la galjanoplastia. Pipetear 1 mL de la suspensión celular en cada cubierto bien (es decir, 3.000 células por pocillo). Coloque las células plateadas en una incubadora de cultivo de tejidos de tri-gas con O2 a 5% (bajo-O2). Una vez la placa de, suavemente pero completamente dispersa células alternando entre un movimiento de arriba/abajo y derecha/izquierda. Repita los movimientos 2 veces más. Incube las células durante la noche. No agitar la placa para mezclar. Pipetear 4 mL de medio a un tubo cónico de 15 mL de reprogramación y colóquelo en la incubadora O bajo2 con una tapa suelta para equilibrar durante la noche. No agregue bFGF y B18R hasta el día siguiente. 3. Inicio de la reprogramación (día 1) Nota: Una vez iniciada la reprogramación, mantenimiento diario se requiere aproximadamente 1 mes. Asegúrese de planificar en consecuencia. Todas las incubaciones celular posterior deben ser realizadas bajo condiciones de baja O2 en 37 ° C, 5% CO2, incubadora de cultivo de tejidos de 5% O2 tri-gas humidificado. Reemplazar el medio forro por lo menos 1 h antes de la transfección. Retire el medio equilibrado de reprogramación de la incubadora O bajo2 . Añadir bFGF a una concentración final de 100 ng/mL y B18R a una concentración final de 200 ng/mL. Mezclar bien. Proceder con 1 bien a la vez, utilice una pipeta de 1 mL para retirar el medio gastado y colocar 1 ml de reprogramación suplementado con bFGF y B18R. Repita esto para cada pozo. No use aspiración que excesivamente seca las células, causa estrés y reduce la eficiencia de reprogramación. Mueva hacia atrás la placa con las células en la incubadora O bajo2 . Transfectar fibroblastos con 5 μl de reactivo de transfección de RNAiMax por 1 μg de ARNm modificado y 1 μl de reactivo de transfección por 6 pmol de miRNA imita por transfección.Nota: Los resultados óptimos se obtienen cuando transfecciones proceden para 16-20 h. El reactivo de transfección es diluido 10 x; los 100 ng/μl cóctel modificado mRNA es diluido x 5; y los imitadores de miRNA pmol/μl 5 mix es 8.33 x con el tampón de transfección antes de complejación. Vea la tabla 1 para un resumen de la configuración de transfección. Mientras prepara la transfección mezcla, minimizar la exposición potencial de los reactivos a Rnasa siguiendo prácticas de laboratorio estándar. Equilibrar una alícuota de la solución de transfección (paso 1.3) por aproximadamente 1 h a TA. No utilice un 37 º C baño María o incubadora para calentar el búfer de transfección. Quitar una sola alícuota de mRNAs modificado (33 μL) y miRNA imita (14 μL) de-80 ° C y calentarlos RT para aproximadamente 3-5 min, hasta que el descongelado. Descongelar las alícuotas a 37 ° C. Los hace girar hacia abajo brevemente en una microcentrífuga. Caliente el reactivo de transfección para RT aproximadamente 3-5 minutos. No use un baño de agua de 37 ° C o incubadora. Invertir el tubo cerrado de 2 a 3 veces para mezclar el reactivo. Girar hacia abajo brevemente en una microcentrífuga. Transferir 279 μl del buffer de transfección de RT en un tubo de microcentrífuga libre de Rnasa. Añadir 31 μl del reactivo de transfección para alcanzar un volumen final de 310 μl. mezcla bien por pipeteo. No no agitar con vortex. Incubar el tubo a temperatura ambiente durante 1 minuto.Nota: Este volumen del reactivo diluido de la transfección es suficiente complejo tanto el mRNA y miRNA modificado imita alícuotas de paso 3.2.3. Añadir 132 μl del buffer de transfección de RT a la alícuota del 33 μl de ARNm modificado. Pipetee suavemente para mezclar: volumen final es 165 μl. Añadir 102,6 μl del buffer de transfección de RT a la alícuota de 14 μl de imitadores de miRNA. Pipetee suavemente para mezclar: volumen final es 116,6 μl. Añadir 165 μl del reactivo de transfección diluido del paso 3.2.5 a la diluida modificado mRNA de paso 3.2.6. Pipeta para mezclar: volumen final es 330 μl. Añadir 116,6 μl del reactivo diluido de la transfección de paso 3.2.5 a la mezcla de imitadores miRNA diluido del paso 3.2.7. Mezclar bien (el volumen final es 233,2 μL). Incubar por 15 min a temperatura ambiente para permitir que el tampón de la transfección con los mRNAs modificados y miRNA imita. Retire la placa con las células de la incubadora O bajo2 . Añada 100 μl (1 μg) de la acomplejada modificado mezcla de transfección de mRNA para cada pozo, gota a gota a través del pozo. Dispersar los complejos de la transfección por suavemente pero bien agitar la placa con un movimiento de arriba/abajo y derecha/izquierda. No agitar la placa para mezclar. Añadir 66,7 μl (20 pmol) de la mezcla de transfección miRNA complejado imita a cada pocillo, gota a gota a través del pozo. Dispersar el complejos de transfección por suavemente pero bien agitar la placa con un movimiento de arriba/abajo y derecha/izquierda. No agitar la placa para mezclar. Coloque las células transfected en la incubadora de tri-gas con O2 a 5% (bajo-O2). Una vez la placa de, se dispersan los complejos de transfección otra vez por suavemente pero bien agitar la placa con un movimiento de arriba/abajo y derecha/izquierda. Pipetear 4 mL de medio de reprogramación en un tubo cónico de 15 mL y colóquelo en la incubadora O bajo2 con tapa suelta para equilibrar durante la noche. No agregue bFGF y B18R hasta el día siguiente. Tubo 1 – dilución de RNAiMax (mix 1) Reactivo de Concentración Volumen Buffer de transfección 279 ΜL RNAiMax (Añadir 2 º) 10 x 31 ΜL Total: 310 μl (incubar 1 minuto a temperatura ambiente) Tubo 2 – ARNm modificado (mezcla 2) Reactivo de Concentración Volumen modificado mRNA de mezcla 100 ng/μl (5 x) 33 ΜL Buffer de transfección ΜL DE 132 Total: 165 μl (añadir un volumen igual de RNAiMax diluido de 1 tubo) Tubo 3 – miRNA imitadores (mezclan 3) Reactivo de Concentración Volumen miRNA imita mix 5 pmol/μl (8.33 x) 14 ΜL Buffer de transfección 102,6 ΜL Total: 116,6 μl (añadir un volumen igual de RNAiMax diluido de 1 tubo) Tabla 1: Preparación de la mezcla de transfección. 4. sustitución de reprogramación medio entre transfecciones (días 2, 4, 6, 8, 10 y 12) Reemplace la transfección posterior mediana 16-20 h según se describe en 3.1.1–3.1.2. Añadir bFGF a una concentración final de 100 ng/mL y B18R a una concentración final de 200 ng/mL en alícuotas de medio reprogramación. Monitor mWasabi expresión diariamente para confirmar la calidad de la transfección con un microscopio configurado para visualizar EGFP.Nota: mWasabi expresión debe ser mínimamente aparente en el día 2 y aumento de brillo con cada transfección adicional. 5. otros-diario transfecciones (días 3, 5, 7, 9, 11 y 13) Realizar la transfección como se describe en el paso 3.2. No cambie el medio en los días de la transfección. Preparar una alícuota de 4 mL de medio de reprogramación y colóquelo en la incubadora O bajo2 para equilibrar el cambio medio en el día siguiente. No agregue bFGF y B18R hasta el día siguiente. 6. procedimientos a realizar después de la Final de la transfección Realizar cambios de media diarias desde el día 14 a través de aproximadamente día 17. Caliente 7 mL de reprogramación medio a 37 ° C. Añadir bFGF a una concentración final de 100 ng/mL.Nota: B18R no es necesario después de la final de la transfección. Más allá del día 14, ya no es necesario equilibrar el medio durante la noche en la incubadora O bajo2 . Retire el medio de todos los pozos con una pipeta serológica. Seguir evitar el uso de la aspiración. Añadir 2 mL de medio suplementado con bFGF por pozo de reprogramación. Los días 17 y 18, analizar los pozos reprogramados en un microscopio invertido o disección. Si las colonias se forman cerca uno al otro debido a la alta eficiencia de reprogramación y no se puede aisladas manualmente, separar las colonias mediante la realización de un pases opcional de pozos reprogramadas que se describe en el paso 7 a continuación. Si las colonias son escasas y bien separados, elegir manualmente los clones directamente en el reprogramado como se describe en el paso 8 y subcultura iPSCs según protocolos estándar. 7. procedimiento opcional: Pases de células reprogramadas pozos utilizando EDTA Preparar 0,5 mM EDTA (EDTA) en DPBS diluyendo la solución madre de EDTA de 0,5 M. Filtro de esterilización EDTA utilizando un sistema de filtración de vacío de 0,22 μm. Prepare el soporte de la célula de vástago (PSC) de pluripotentes libre de alimentador (por ejemplo, mTeSR1) según las instrucciones del fabricante. Caliente previamente 32 mL de medio de PSC a 37 ° C. Cubra todos los pozos de dos placas de formato 6-bien con hESC-calificado de matriz extracelular (ECM) siguiendo las instrucciones del fabricante. Sellar las placas con la película de parafina e Incube por 1 h a TA. Aspirar la solución ECM de las placas precalentadas y reemplazarlo con 2 mL de medio PSC por pozo. No permita que la superficie de los pozos se sequen. Colóquelos a un lado. Aspirar el medio de la reprogramación de 2 pozos reprogramadas en un día cuando las colonias son grandes y claramente formado (generalmente día 18). Enjuague una vez con 1 mL de EDTA y aspirado. Añadir 1 mL de EDTA por pozo. Incubar durante 4 min a 37 ° C. Suavemente Retire la placa de la incubadora y coloque en la bioseguridad gabinete.Nota: en este punto, las células pueden ser adheridos muy libremente y fácilmente desalojada. Aspirar cuidadosamente el EDTA de ambos pozos. Añadir 3 mL de medio PSC precalentado a cada uno bien tratada con EDTA. Use un raspador de célula para suavemente pero completamente desalojar las células de ambos pozos. Utilice una pipeta serológica para pipetear la suspensión de células y romper grumos grandes. No pipetear hasta que todos los grupos de células se han ido. Conservar grupos de iPSC.Nota: Galjanoplastia grumos grandes no afectará a consecuencia de Colonia de iPSC. Si existen grupos excesivamente grandes de la célula, simplemente evitar la transferencia en el siguiente plato. Con una pipeta serológica, distribuir las células de cada pozo tratada con EDTA por pipetear 0.5 mL en cada pocillo de la placa de la pozo 6 revestida de ECM.Nota: No combinar las células de los pozos reprogramadas (es decir, reprogramadas bien 1 debe distribuirse uniformemente en la primera placa de 6 pozos y reprogramado 2 bien debe distribuirse uniformemente en la segunda placa de 6 pozos). Volver las células plateadas a la incubadora O bajo2 . Para distribuir uniformemente las células, agitar cada placa y hacia atrás y de lado a lado. Remolino no. Reemplazar el medio PSC diariamente. 8. cosecha iPSC colonias Caliente previamente 15 mL de medio PSC a 37 ° C. Cubrir todos los pocillos de una placa de 6 pozos solo con ECM hESCs cualificado siguiendo las instrucciones del fabricante. Sellar las placas con la película de parafina e Incube por 1 h a TA. Aspire el medio de cultivo de los pozos se utiliza para recoger iPSCs. Enjuague una vez con 1 mL de EDTA y aspirado. Añadir 1 mL de EDTA por pozo. Incubar durante 4 min a 37° C. Mientras que las células están incubando, aspirar la solución ECM de las placas precalentadas y reemplazar con 2 mL de medio PSC por pozo. Fijar las placas a un lado. Suavemente Retire la placa con iPSCs para ser recogido de la incubadora y coloque en la bioseguridad gabinete.Nota: en este punto, las células pueden ser adheridos muy libremente y fácilmente desalojada. Aspirar cuidadosamente el EDTA. Muy suavemente, añadir 3 mL de medio precalentado de PSC, teniendo cuidado de no para desalojar las colonias de iPSC. Mover la placa a un invertido o disección alcance para mejor visualizar las colonias. Preparar una pipeta de 1 mL con una punta estéril. Presione el émbolo completamente, después utilizar la punta para raspar suavemente una colonia mientras poco a poco líquido en la punta para recoger la Colonia. Drenaje como medio poco como sea posible mientras la colonia de iPSC. Para transferir la Colonia, pipetear arriba y abajo 3-4 veces en un solo pozo de la placa revestida de ECM de paso 8.2. Repita hasta 6 colonias han sido recogidas y transferidos en pocillos individuales. Elegir no más de 2 colonias de cualquier bien individual si un pases opcional que se describe en el paso 7 se ha realizado. Utilizar un protocolo estándar humano célula de vástago para congelar a todos los pozos restantes. Descongelar y volver a placa acciones congeladas Si más colonias deben ser recogidas posteriormente. 9. Caracterización de iPSCs Realizar TRA-1-60 de tinción para análisis de reprogramación eficiencia (día 18).Nota: 2 de 3 pozos reprogramadas son pasados para cosecha futura Colonia. Los restantes pueden ser utilizados para la tinción de TRA-1-60. Este procedimiento puede realizarse en la mesa de laboratorio. Lave el reprogramado con 1 mL de PBS. Fijar las células con metanol helado a-20 ° C durante 5 minutos. Aspire metanol. Seco bien durante aproximadamente 2 minutos tenga cuidado de no secar demasiado. Las células han secado lo suficiente cuando se convierten en un color transparente/mate. Lave el bien 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos con agitación suave. Durante los lavados, preparar 3 mL de peróxido de hidrógeno 3% en PBS. Aspire el PBS. Añadir 2 mL de solución diluida de peróxido. Incubar por 15 min a temperatura ambiente con agitación suave. Preparar 4 mL de la solución de bloqueo: 10% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS. Aspire la solución de peróxido. Lave bien 2 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos. Aspire PBS y añadir 2 mL de solución de bloqueo en el pozo. Incubar durante 1 h a TA. Lave el bien 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos con agitación suave. Diluir el anticuerpo primario anti-TRA-1-60 al 1: 100 en la solución de bloqueo con 0.05% de azida sódica. Preparar 1 mL de la dilución del anticuerpo 1 bien de un plato de formato 6-bien. Agregar la dilución de anticuerpo al pozo y envolver el plato con parafilm para evitar la evaporación. Incubar durante una noche a 4 ° C con agitación suave.Nota: Si es necesario, puede hacerse la incubación con el anticuerpo primario por 1 h a temperatura ambiente con agitación suave. La dilución del anticuerpo primario puede ser reutilizada hasta 5 veces. Tras la incubación con el anticuerpo primario, lave el bien 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos con agitación suave. Diluir el anticuerpo conjugado con HRP de anti-ratón secundario en el 1: 200 en la solución de bloqueo. Incubar el pozo con la dilución del anticuerpo secundario por 2 h a temperatura ambiente con agitación suave. La dilución del anticuerpo secundario de aspirar y lavar el bien 3 veces con 1 mL de PBS durante 5 minutos con agitación suave. Durante el tercer lavado, preparar la solución de substrato siguiendo las instrucciones del fabricante. Después del último lavado, Aspire PBS. Añadir 1 mL de la solución sustrato e incubar hasta que el color deseado convierte (aproximadamente 10 min). Aspirar la solución de sustrato. Enjuague bien con agua durante 5 minutos agitando suavemente. Contar las colonias, si lo desea. Reprogramación de eficiencia = (número de colonias) / (número de fibroblastos plateados) x 100%. Para el almacenamiento a largo plazo, aspirar el agua de la placa teñida y deje secar al aire durante la noche en el sello de excelencia la placa seca con parafilm y almacenar a 4 ° C hasta por 2 años evaluar la eficiencia de reprogramación más adelante.